تورم سر

تکنیک PCR. PCR (واکنش زنجیره ای پلیمراز). نحوه انجام تشخیص PCR، اندیکاسیون ها، نحوه آماده شدن برای مطالعه، نتیجه PCR. تجزیه و تحلیل PCR - چیست؟

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)- روشی از فناوری بیوشیمیایی در زیست شناسی مولکولی است که با هدف افزایش یک یا چند نسخه از قطعات DNA تا چند درجه انجام می شود که به شما امکان می دهد از چندین هزار تا میلیون ها نسخه از یک توالی DNA خاص ایجاد کنید.

روش PCR که در سال 1983 توسط کری مولیس ابداع شد، اکنون یک روش رایج و اغلب ضروری است که در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی پزشکی و بیولوژیکی برای کاربردهای مختلف مورد استفاده قرار می‌گیرد. اینها شامل شبیه سازی DNA برای توالی یابی، فیلوژنی مبتنی بر DNA، یا تجزیه و تحلیل عملکردی ژن ها می شود. تشخیص بیماری های ارثی؛ شناسایی اثر انگشت ژنتیکی (مورد استفاده در شاخه های پزشکی قانونی و آزمایش پدری) و همچنین تشخیص و تشخیص بیماری های عفونی. در سال 1993، مولیس به همراه مایکل اسمیت برای کارهایشان در زمینه PCR جایزه نوبل شیمی را دریافت کردند.

این روش مبتنی بر چرخه حرارتی است که شامل چرخه‌های مکرر واکنش‌های گرمایش و خنک‌کننده برای دناتوره کردن و تکثیر DNA توسط آنزیم‌ها است. پرایمرها، (قطعات کوتاه DNA) حاوی توالی هایی که مکمل محل هدف به همراه DNA پلیمراز (که روش از آن نامگذاری شده است)، اجزای کلیدی برای تحریک انتخابی و تقویت مجدد هستند. در فرآیند PCR، خود DNA سنتز شده به عنوان الگوی همانندسازی استفاده می‌شود و یک واکنش زنجیره‌ای را به حرکت در می‌آورد که در آن DNA الگو به صورت تصاعدی تقویت می‌شود. PCR را می توان به طور قابل توجهی تغییر داد تا طیف وسیعی از دستکاری های ژنتیکی را انجام دهد.

تقریباً تمام کاربردهای PCR از یک DNA پلیمراز پایدار در برابر حرارت مانند Taq polymerase استفاده می کنند، آنزیمی که در اصل از باکتری ها جدا شده است. قمقمهآبزیان. این DNA پلیمراز به صورت آنزیمی رشته جدیدی از DNA را از بلوک های ساختمانی DNA - نوکلئوتیدها، با استفاده از DNA تک رشته ای به عنوان الگو و الیگونوکلئوتیدهای DNA (که آغازگرهای DNA نیز نامیده می شوند) که برای شروع سنتز DNA مورد نیاز هستند، جمع می کند. اکثریت قریب به اتفاق روش‌های PCR از چرخه حرارتی استفاده می‌کنند، یعنی گرمایش و خنک‌کردن متناوب نمونه PCR در یک سری مراحل دمایی مشخص. این مراحل چرخه حرارتی ابتدا برای جداسازی فیزیکی دو رشته مارپیچ دوگانه DNA در دمای بالا در فرآیندی به نام دناتوره شدن DNA مورد نیاز است. در دمای پایین تر، هر رشته به عنوان یک الگو در سنتز DNA توسط DNA پلیمراز به منظور تقویت انتخابی منطقه DNA هدف استفاده می شود. انتخاب‌پذیری PCR با استفاده از پرایمرهایی که مکمل ناحیه DNA هدف برای تقویت تحت شرایط چرخه حرارتی خاص هستند، به دست می‌آید.

اصول تشخیص PCR

PCR برای تقویت بخش خاصی از زنجیره DNA (DNA هدف) استفاده می شود. اکثر روش‌های PCR معمولاً قطعات DNA را تا 10000 جفت باز (kb) تقویت می‌کنند، اگرچه برخی از روش‌ها اجازه می‌دهند قطعات تا 40 کیلوبایت مقیاس شوند. این واکنش مقدار محدودی از محصول تقویت شده نهایی را تولید می کند که توسط معرف های موجود در واکنش و بازخورد-مهار محصولات واکنش کنترل می شود.

کیت اصلی PCR به چندین جزء و معرف نیاز دارد. آنها عبارتند از:

الگوی DNAکه حاوی ناحیه DNA هدف برای تکثیر است.
دو پرایمر،مکمل انتهای 3' هر یک از رشته های حسی و ضد سن DNA هدف است.
تاق پلیمرازیا DNA پلیمراز دیگری که در دمای بهینه حدود 70 درجه سانتیگراد کار می کند.
تری فسفات های دئوکسی نوکلئوزید(dNTPs؛ گروه های تری فسفات حاوی نوکلئوتید)، بلوک های ساختمانی که از آن DNA پلیمراز یک رشته DNA جدید را سنتز می کند.
محلول بافرفراهم کردن شرایط شیمیایی مناسب برای فعالیت و پایداری بهینه DNA پلیمراز.
کاتیون های دو ظرفیتی،یون منیزیم یا منگنز؛ معمولاً از Mg2+ استفاده می‌شود، اما Mn2+ را می‌توان برای جهش‌زایی DNA با واسطه PCR نیز استفاده کرد، زیرا غلظت‌های بالاتر Mn2+ میزان خطا را در طول سنتز DNA افزایش می‌دهد.
کاتیون های تک ظرفیتییون های پتاسیم

PCR معمولاً در حجم واکنش 10-200 میکرولیتر در لوله های واکنش کوچک (حجم 0.2-0.5 میلی لیتر) در یک تقویت کننده حرارتی انجام می شود. سیکلر لوله های واکنش را گرم و سرد می کند تا به دمای مورد نیاز برای هر مرحله از واکنش برسد. بسیاری از چرخه‌سازهای مدرن از اثر پلتیه استفاده می‌کنند که به سادگی با معکوس کردن جهت جریان الکتریکی، مجموعه لوله PCR را گرم و خنک می‌کند. لوله های واکنشی با دیواره نازک هدایت حرارتی مطلوب را برای اطمینان از تعادل حرارتی سریع افزایش می دهند. سیکلرهای قدیمی که درب گرم شده ندارند به یک لایه روغن روی سطح مخلوط واکنش یا یک مهره موم در یک ویال نیاز دارند.

ترتیب رویه

به طور معمول، PCR شامل یک سری 20-40 تغییر دمای مکرر به نام سیکل است که هر چرخه معمولاً شامل 2-3 مرحله دمایی گسسته، معمولاً سه مرحله است. دوچرخه سواری اغلب با یک مرحله دمایی شروع می شود و به پایان می رسد (به اصطلاح پیش بینی) در دمای بالا (> 90 درجه سانتیگراد) برای انبساط نهایی محصول یا نگهداری کوتاه مدت. دماهای مورد استفاده و مدت زمان اعمال آنها در هر سیکل به پارامترهای زیادی بستگی دارد. اینها عبارتند از آنزیم مورد استفاده برای سنتز DNA، غلظت یونهای دو ظرفیتی و dNTPها در واکنش و نقطه ذوب (Tm) آغازگرها.

مرحله اولیه سازی:این مرحله شامل حرارت دادن واکنش به دمای 94-96 درجه سانتیگراد (یا 98 درجه سانتیگراد در صورت استفاده از پلیمرازهای بسیار پایدار در برابر حرارت) است که به مدت 1-9 دقیقه انجام می شود. این مرحله فقط برای DNA پلیمرازهایی که نیاز به فعال سازی حرارتی دارند، به اصطلاح شروع داغ PCR لازم است.
مرحله دناتوراسیون:این اولین رویداد چرخه حرارتی منظم است و شامل حرارت دادن واکنش به 94-98 درجه سانتیگراد به مدت 20-30 ثانیه است. این باعث برش الگوی DNA با تخریب پیوندهای هیدروژنی بین بازهای مکمل و تشکیل مولکول های DNA تک رشته ای می شود.
مرحله بازپخت:دمای واکنش به مدت 20-40 ثانیه به 50-65 درجه سانتیگراد کاهش می یابد که به پرایمرها اجازه می دهد تا به الگوی DNA تک رشته ای متصل شوند. به طور معمول دمای بازپخت حدود 3-5 درجه سانتیگراد کمتر از Tm پرایمرهای مورد استفاده است. پیوندهای هیدروژنی DNA-DNA پایدار تنها زمانی تشکیل می شوند که توالی پرایمر بیشتر با الگوی توالی مطابقت داشته باشد. پلیمراز به هیبرید پرایمر-قالب متصل می شود و سنتز DNA را آغاز می کند.
مرحله انبساط / ازدیاد طول:دما در طول این مرحله به DNA پلیمراز مورد استفاده بستگی دارد. Taq polymerase دمای فعالیت بهینه خود را در 75-80 درجه سانتیگراد دارد. معمولاً برای این آنزیم از دمای 72 درجه سانتی گراد استفاده می شود. در این مرحله، DNA پلیمراز با افزودن dNTPهایی که مکمل الگو در جهت 5 اینچ به 3 هستند، یک رشته DNA جدید مکمل رشته الگوی DNA را سنتز می کند و گروه 5"-فسفات dNTP را به گروه هیدروکسیل 3" پیوند می دهد. در انتهای DNA حاصل (در حال گسترش). زمان انبساط هم به DNA پلیمراز مورد استفاده و هم به طول قطعه DNA که باید تکثیر شود بستگی دارد. به طور معمول، در دمای بهینه خود، DNA پلیمراز هزار باز در دقیقه پلیمریزه می شود. تحت شرایط بهینه، یعنی در غیاب محدودیت‌ها به دلیل محدود کردن بسترها یا معرف‌ها، در هر مرحله انبساط، مقدار DNA هدف دو برابر می‌شود و در نتیجه تکثیر نمایی (هندسی) یک قطعه DNA حاصل می‌شود.
تمدید نهایی:این تنها مرحله است که گاهی در دمای 70-74 درجه سانتیگراد به مدت 5-15 دقیقه پس از آخرین چرخه PCR انجام می شود تا اطمینان حاصل شود که DNA تک رشته ای باقیمانده به طور کامل کشیده شده است.
انتظار نهایی:این مرحله در دمای 4-15 درجه سانتیگراد به طور نامحدود می تواند برای کوتاه نگه داشتن واکنش استفاده شود. برای بررسی اینکه آیا PCR قطعه DNA مورد انتظار را سنتز کرده است (که گاهی اوقات به آن "تقویت کننده" یا "amplicon" نیز گفته می شود)، از الکتروفورز ژل آگارز برای جداسازی محصولات PCR بر اساس اندازه استفاده می شود. اندازه محصولات PCR با مقایسه با یک نردبان DNA (نشانگر وزن مولکولی) که حاوی قطعات DNA با اندازه شناخته شده است، بر روی یک ژل همراه با محصولات PCR تعیین می شود.

مراحل واکنش زنجیره ای پلیمراز

فرآیند PCR را می توان به سه مرحله تقسیم کرد:

تقویت نمایی: در طول هر چرخه مقدار محصول دو برابر می شود (با فرض 100% راندمان واکنش). واکنش بسیار حساس است: فقط به مقدار کمی DNA نیاز است.
مرحله تسطیحواکنش کند می شود زیرا DNA پلیمراز فعالیت خود را از دست می دهد و مصرف معرف هایی مانند dNTP ها و پرایمرها باعث محدود شدن آنها می شود. .
فلات: محصول دیگر به دلیل کاهش معرف ها و آنزیم ها تجمع نمی یابد.

بهینه سازی PCR

در عمل، PCR ممکن است موفقیت آمیز نباشد دلایل مختلفبه ویژه به دلیل حساسیت آن به آلودگی، که باعث تکثیر محصولات جانبی DNA می شود. در این راستا، تعدادی تکنیک و روش برای بهینه سازی شرایط PCR ایجاد شده است. آلودگی DNA خارجی توسط پروتکل ها و روش های آزمایشگاهی انجام می شود که مخلوط های قبل از PCR از آلاینده های DNA بالقوه را خالص می کند. این معمولاً شامل جدا کردن کیت‌های PCR از مناطق برای تجزیه و تحلیل یا خالص‌سازی محصولات PCR، استفاده از ظروف پلاستیکی یکبار مصرف، و تمیز کردن کامل سطح کار بین مراحل واکنش است. تکنیک‌های طراحی پرایمر نقش مهمی در بهبود جداسازی محصولات PCR و جلوگیری از تشکیل محصولات جانبی دارند و استفاده از اجزای بافر جایگزین یا آنزیم‌های پلیمراز می‌تواند به تقویت نواحی طولانی یا مشکل‌ساز DNA کمک کند. افزودن معرف هایی مانند فرمامید به سیستم های بافر می تواند ویژگی و بازیابی PCR را افزایش دهد. شبیه سازی کامپیوتری نتایج نظری PCR (PCR الکترونیکی) می تواند برای کمک به طراحی پرایمر انجام شود.

کاربرد PCR

جداسازی انتخابی DNA

PCR امکان جداسازی قطعات DNA از DNA ژنومی را با تکثیر انتخابی یک ناحیه DNA خاص فراهم می کند. این کاربرد PCR مکمل بسیاری از تکنیک‌ها است، مانند ایجاد پروب‌های هیبریداسیون برای ساترن یا شمال بلات و تکنیک‌های شبیه‌سازی DNA، که نیاز به مقادیر زیادی DNA نشان‌دهنده ناحیه خاصی از DNA است. PCR این روش ها را با محتوای بالایی از DNA خالص فراهم می کند که امکان تجزیه و تحلیل نمونه های DNA را حتی با مقدار کمی ماده اولیه فراهم می کند.

از دیگر کاربردهای PCR می توان به توالی یابی DNA برای شناسایی توالی های تقویت شده با PCR ناشناخته اشاره کرد، که در آن می توان از یکی از پرایمرهای تقویت کننده در توالی یابی Sanger استفاده کرد، جداسازی توالی DNA برای تسریع فناوری های DNA نوترکیب شامل درج یک توالی DNA در یک پلاسمید یا ماده ژنتیکی. از یک موجود دیگر کلنی های باکتری (E. coli) می توانند به سرعت توسط PCR برای تصحیح طراحی DNA ناقل غربال شوند. PCR همچنین می تواند برای انگشت نگاری ژنتیکی استفاده شود. تکنیکی که در پزشکی قانونی برای شناسایی یک فرد یا ارگانیسم با مقایسه DNA تجربی با استفاده از روش‌های مختلف PCR استفاده می‌شود.

برخی از روش‌های PCR «اثرانگشت» قدرت تمایز بالایی دارند و می‌توان از آنها برای تعیین روابط ژنتیکی بین افراد، مانند والد-فرزند یا خواهر و برادر استفاده کرد و در آزمایش پدری استفاده می‌شود. این تکنیک همچنین می تواند برای تعیین روابط تکاملی بین موجودات استفاده شود.

تقویت و کمی سازی DNA

از آنجایی که PCR تعداد کپی مناطق هدف DNA را افزایش می دهد، PCR می تواند برای تجزیه و تحلیل مقادیر بسیار کمی از نمونه استفاده شود. این اغلب برای تحقیقات پزشکی قانونی که فقط مقادیر کمی از DNA به عنوان مدرک در دسترس است، بسیار مهم است. PCR همچنین می تواند برای تجزیه و تحلیل DNA باستانی که ده ها هزار سال قدمت دارد استفاده شود. این روش‌های PCR با موفقیت بر روی حیواناتی مانند ماموت 40000 ساله و همچنین روی DNA انسان در کاربردهایی از تجزیه و تحلیل مومیایی‌های مصری تا شناسایی تزار روسیه استفاده شده است.

روش‌های کمی PCR، مقدار یک توالی معین را در یک نمونه تخمین می‌زنند، روشی که اغلب برای تعیین کمیت سطح بیان ژن استفاده می‌شود. Real-time PCR یک ابزار تعیین کمیت DNA است که تجمع DNA محصول را پس از هر چرخه تقویت PCR اندازه گیری می کند.

PCR در تشخیص بیماری ها

PCR امکان تشخیص زودهنگام بیماری های بدخیم مانند لوسمی و لنفوم را فراهم می کند که در حال حاضر در تحقیقات سرطان بسیار توسعه یافته است و در حال حاضر به طور معمول استفاده می شود. PCR را می توان به طور مستقیم بر روی نمونه های DNA ژنومی برای شناسایی سلول های بدخیم اختصاصی جابجایی با حساسیت حداقل 10000 برابر بیشتر از روش های دیگر انجام داد.

PCR همچنین امکان تشخیص ارگانیسم های کشت نشده یا کند رشد مانند مایکوباکتریوم ها، باکتری های بی هوازی و ویروس ها را از کشت بافت و مدل های حیوانی فراهم می کند. اساس كاربردهاي تشخيصي PCR در زمينه ميكروب شناسي، شناسايي عوامل عفوني و تمايز سويه هاي غير بيماري زا از بيماري زا به دليل ژن هاي خاص است.

DNA ویروسی را می توان با PCR نیز تشخیص داد. پرایمرها باید مختص توالی های DNA هدف ویروس باشند و PCR می تواند برای تست های تشخیصی DNA یا تعیین توالی ژنوم ویروس استفاده شود. حساسیت بالای PCR باعث می شود که ویروس ها بلافاصله پس از عفونت و حتی قبل از شروع بیماری شناسایی شوند. این تشخیص زودهنگام ویروس می تواند گزینه های درمانی قابل توجهی را در اختیار پزشکان قرار دهد. مقدار ویروس ("بار ویروسی") در یک بیمار نیز می تواند تعیین شود روش کمیتجزیه و تحلیل DNA بر اساس PCR.

تغییرات در روش های واکنش زنجیره ای پلیمراز پایه

PCR اختصاصی آلل: روش تشخیصی یا شبیه سازی بر اساس پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی (SNPs) (تفاوت های تک باز در DNA). نیاز به دانش قبلی از توالی DNA، از جمله تفاوت‌های بین آلل‌ها، دارد و از آغازگرهایی استفاده می‌کند که انتهای 3' آنها SNP‌ها را در بر می‌گیرد.تقویت PCR دقیق در صورت عدم تطابق بین الگو و پرایمر بسیار کمتر کارآمد است، بنابراین تقویت موفقیت‌آمیز با SNP خاص پرایمر در مورد حضور SNP های خاص در دنباله سیگنال می دهد.
مونتاژ PCR یا مونتاژ چرخه پلیمراز (PCP):سنتز مصنوعی توالی‌های DNA طولانی توسط PCR بر روی مجموعه‌ای از اولیگونوکلئوتیدهای بلند با بخش‌های همپوشانی کوتاه. الیگونوکلئوتیدها به طور متناوب بین جهت رشته های حسی و آنتی سنس تغییر می کنند و بخش های روی هم قرار گرفته ترتیب قطعات PCR را تعیین می کنند و در نتیجه به طور انتخابی محصول نهایی DNA طولانی را تولید می کنند.
PCR نامتقارن: ترجیحاً یک رشته DNA را در یک الگوی DNA دو رشته ای تقویت می کند. در جستجوی توالی و هیبریداسیون که در آن تقویت تنها یکی از دو رشته مکمل مورد نیاز است استفاده می شود. PCR به طور معمول انجام می شود، اما با مقدار زیادی پرایمر برای زنجیره در نظر گرفته شده برای تقویت. به دلیل تقویت آهسته (پیشرفت محاسباتی) در پایان واکنش پس از استفاده از پرایمر محدود کننده، سیکل های PCR اضافی مورد نیاز است. آخرین اصلاح این فرآیند که با نام "LATE-PCR" (خطی بودن پس از فاز نمایی - PCR) شناخته می شود، از یک آغازگر محدود کننده با نقطه ذوب بالاتر (Tm) نسبت به مازاد پرایمر برای حفظ راندمان واکنش استفاده می کند، زیرا غلظت پرایمر محدود کننده کاهش می یابد. در وسط واکنش
Dial-out PCR: یک روش بسیار موازی برای به دست آوردن مولکول های DNA دقیق برای سنتز ژن. مجموعه پیچیده مولکول‌های DNA توسط برچسب‌های کناری منحصربه‌فرد به توالی‌یابی موازی عظیم اصلاح می‌شود. پرایمرهای هدایت شده توسط برچسب، سپس مولکول های توالی یابی شده را توسط PCR فراهم می کنند.
تقویت وابسته به هلیکاز:مشابه PCR سنتی است، اما به دمای ثابت نسبت به چرخه از طریق چرخه های دناتوراسیون و بازپخت / انبساط نیاز دارد. DNA هلیکاز، آنزیمی که DNA را باز می کند، به جای دناتوراسیون حرارتی استفاده می شود.
شروع داغ PCR: تکنیکی که تقویت غیر اختصاصی را در طول راه اندازی اولیه مراحل PCR کاهش می دهد. می توان به صورت دستی با حرارت دادن اجزای واکنش تا دمای دناتوره شدن (به عنوان مثال 95 درجه سانتیگراد) قبل از افزودن پلیمراز انجام داد. سیستم‌های آنزیمی تخصصی ایجاد شده‌اند که فعالیت پلیمراز را در دمای اتاق، یا با اتصال آنتی‌بادی یا در حضور مهارکننده‌های متصل به کووالانسی که تنها پس از یک مرحله فعال‌سازی در دمای بالا جدا می‌شوند، مهار می‌کنند. شروع گرم/پایان سرد PCR با پلیمرازهای هیبریدی جدید که در دمای محیط غیرفعال هستند و در دمای ازدیاد طول فورا فعال می شوند به دست می آید.
PCR اختصاصی توالی بین ریزماهواره ای (ISSR):روش انگشت نگاری DNA PCR که تعداد کپی نواحی بین توالی های تکرار ساده را افزایش می دهد تا اثر انگشت منحصر به فردی از طول قطعه تقویت شده به دست آید.
معکوس PCRبه طور گسترده برای تعریف مناطق توالی در اطراف درج ژنومی استفاده می شود. این شامل یک سری از شکاف های DNA و خود بستن است که منجر به توالی های شناخته شده در دو انتهای توالی ناشناخته می شود.
PCR با واسطه بستن:از پیوندهای کوچک DNA مرتبط با DNA مورد نظر و چند آغازگر مرتبط با پیوند دهنده های DNA استفاده می کند. برای توالی یابی DNA، راه رفتن ژنوم و ردپای DNA استفاده می شود.
PCR اختصاصی متیلاسیون(MSP): توسط Stephen Bailin و Jim Herman در دانشکده پزشکی جانز هاپکینز ساخته شده است و برای تشخیص متیلاسیون جزایر CpG در DNA ژنومی استفاده می شود. DNA ابتدا با بی سولفیت سدیم درمان می شود، که بازهای سیتوزین متیله نشده را به اوراسیل تبدیل می کند که توسط پرایمرهای PCR به عنوان تیمین شناخته می شود. سپس دو PCR بر روی DNA اصلاح شده با استفاده از مجموعه ای از پرایمرهای یکسان به جز هر جزیره CpG در توالی پرایمر انجام می شود. در این نقاط، یک مجموعه از پرایمرها DNA را با سیتوزین ها تشخیص می دهند تا تعداد کپی DNA متیله را افزایش دهند و یک مجموعه DNA را با اوراسیل یا تیمین برای تکثیر DNA غیر متیله می شناسند. MSP با استفاده از qPCR همچنین می تواند برای به دست آوردن اطلاعات کمی و نه کیفی در مورد متیلاسیون انجام شود.
مینی پرایمر - PCR:پلیمرازهای مقاوم در برابر حرارت (S-Tbr) استفاده می شود که می تواند از آغازگرهای کوتاه ("smalligo") با تعدادی 9 یا 10 نوکلئوتید گسترش یابد. این تکنیک به PCR اجازه می دهد تا نواحی مرتبط با پرایمرهای کوچکتر را هدف قرار دهد و برای تقویت توالی های DNA حفاظت شده مانند ژن rRNA 16S (یا یوکاریوتی 18S) استفاده می شود.
تقویت پروب وابسته به بستن چندگانه (MLPA): اجازه می دهد تا چندین هدف را تنها با یک جفت پرایمر تقویت کنید، بنابراین از محدودیت های وضوح PCR جلوگیری می کند.
Multiplex PCRشامل چندین مجموعه پرایمر در یک مخلوط PCR به منظور به دست آوردن آمپلیکون هایی با اندازه های مختلف است که برای توالی های مختلف DNA خاص هستند. با تمرکز روی چندین ژن به طور همزمان، می توان اطلاعات بیشتری را در طی یک آزمایش به دست آورد که در غیر این صورت چندین برابر معرف بیشتر و زمان بیشتری برای انجام آن نیاز دارد. دمای بازپخت برای هر مجموعه پرایمر باید برای عملکرد صحیح در یک واکنش واحد و با اندازه آمپلیکون بهینه شود. به این معنی که طول جفت پایه آنها باید به اندازه کافی متفاوت باشد تا در هنگام مشاهده توسط ژل الکتروفورز، نوارهای متمایز تشکیل شود.
Nested PCR: با کاهش پس زمینه به دلیل تقویت غیر اختصاصی DNA، ویژگی تکثیر DNA را افزایش می دهد. دو مجموعه پرایمر در دو PCR متوالی استفاده می شود. در واکنش اول، از یک جفت پرایمر برای سنتز محصولات DNA استفاده می شود که علاوه بر هدف مورد نظر، ممکن است همچنان از قطعات DNA تکثیر شده غیر اختصاصی تشکیل شود. سپس محصولات در یک PCR دوم با مجموعه پرایمری استفاده می‌شوند که محل‌های اتصال آن به طور کامل یا جزئی با انتهای 3' هر یک از آغازگرهای مورد استفاده در واکنش اول متفاوت است. Nested PCR اغلب در تکثیر اختصاصی قطعات طولانی DNA موفق‌تر از PCR سنتی، اما نیاز به دانش دقیق تری از توالی هدف دارد.
PCR با پسوندهای همپوشانییا اتصال با پسوندهای همپوشانی(SOE): یک تکنیک مهندسی ژنتیک که برای اتصال دو یا چند قطعه DNA که حاوی توالی های مکمل هستند استفاده می شود. برای اتصال قطعات DNA حاوی ژن هایی که توالی ها یا جهش ها را تنظیم می کنند استفاده می شود. این تکنیک امکان ایجاد ساختارهای خاص و طولانی DNA را فراهم می کند.
PCR کمی (QPCR):برای اندازه گیری مقدار محصول PCR (معمولاً در زمان واقعی) استفاده می شود. کمیت های اولیه DNA، cDNA یا RNA را تعیین می کند. qPCR به طور گسترده ای برای تعیین وجود یک توالی DNA در یک نمونه و تعداد کپی آن در نمونه استفاده می شود. PCR کمی در زمان واقعی از دقت بسیار بالایی برخوردار است. روش‌های QRT-PCR (یا QF-PCR) از رنگ‌های فلورسنت مانند Sybr Green، EvaGreen یا پروب‌های DNA حاوی فلوروفور مانند TaqMan برای اندازه‌گیری مقدار محصول تقویت‌شده در زمان واقعی استفاده می‌کنند. گاهی اوقات به عنوان RT-PCR (Real-time PCR) یا RQ-PCR نامیده می شود. QRT-PCR یا RTQ-PCR مخفف های مناسب تری هستند زیرا RT-PCR معمولاً به PCR رونویسی معکوس اشاره دارد که اغلب همراه با qPCR استفاده می شود.
رونویسی معکوس PCR (RT-PCR):برای افزایش تعداد کپی DNA از RNA. ترانس کریپتاز معکوس RNA را به cDNA رونویسی می کند که سپس توسط PCR تقویت می شود. RT-PCR به طور گسترده در پروفایل بیان برای تشخیص بیان ژن یا تعیین توالی رونوشت RNA، از جمله محل شروع و توقف رونویسی استفاده می شود. اگر توالی DNA ژنومی یک ژن مشخص باشد، می توان از RT-PCR برای ترسیم موقعیت اگزون ها و اینترون ها در ژن استفاده کرد. انتهای 5' یک ژن (مرتبط با محل شروع رونویسی) معمولاً با RACE-PCR (تقویت سریع انتهای cDNA) تعیین می شود.
PCR فاز جامد: معانی مختلفی را شامل می شود، از جمله "تقویت پولونیا" (مثلاً در جایی که کلنی های PCR روی یک ماتریکس ژل ساخته می شوند)، "Bridge PCR" (پرایمرها به صورت کووالانسی به سطح تکیه گاه جامد متصل می شوند)، PCR فاز جامد سنتی (که در آن "PCR نامتقارن" در حضور پرایمرهای حامل یک تکیه گاه جامد با دنباله ای مطابق با یکی از پرایمرهای آبی استفاده می شود، و PCR فاز جامد تقویت شده (که در آن PCR فاز جامد معمولی را می توان با استفاده از پرایمرهای Tm بالا و تو در تو با پشتیبانی جامد بهبود بخشید. گزینه اعمال یک "گام" حرارتی برای ترویج تشکیل پرایمرها با پشتیبانی محکم).
PCR نا متقارن حرارتی (TAIL-PCR):برای جداسازی یک دنباله ناشناخته به دنبال یک دنباله شناخته شده استفاده می شود. در یک توالی شناخته شده، TAIL-PCR از یک جفت پرایمر تو در تو با دماهای بازپخت متفاوت استفاده می کند. پرایمر degenerate برای تقویت در جهتی متفاوت از توالی ناشناخته استفاده می شود.
Touchdown PCR (Step PCR):یک نوع PCR با هدف کاهش پس‌زمینه غیر اختصاصی با کاهش تدریجی دمای بازپخت همزمان با پیشرفت چرخه‌های PCR. دمای بازپخت در چرخه های اولیه معمولاً چند درجه (3-5 درجه سانتیگراد) بالاتر از Tm پرایمرهای استفاده شده است، در حالی که در سیکل های بعدی، دما چند درجه (3-5 درجه سانتیگراد) کمتر از Tm پرایمر است. آغازگرها دماهای بالاتر ویژگی بیشتری را برای اتصال پرایمر به ارمغان می آورد و دماهای پایین تر امکان تقویت کارآمدتری از محصولات خاص تولید شده در چرخه های اولیه را فراهم می کند.
PAN-AC: از شرایط همدما برای تقویت استفاده می کند و می تواند برای سلول های زنده اعمال شود.
قدم زدن سریع جهانی در ژنوم: برای راه رفتن ژنوم و انگشت نگاری ژنتیکی با استفاده از PCR "دوطرفه" اختصاصی تر نسبت به روش های سنتی "یک طرفه" (استفاده از تنها یک پرایمر اختصاصی ژن و یک پرایمر مشترک - که می تواند منجر به "نویز" مصنوعی شود) به دلیل مکانیسم ، از جمله تشکیل یک ساختار کمند. مشتقات ساده شده UFW عبارتند از "Lane RAGE" (PCR تو در تو برای تکثیر سریع انتهای DNA ژنومی)، "5" RACE Lane و "3" RACE Lane.
که درسیلیکوPCR(PCR دیجیتال، PCR مجازی، e-PCR، e-PCR) به ابزارهای محاسباتی مورد استفاده برای محاسبه نتایج یک واکنش زنجیره ای پلیمراز نظری با استفاده از مجموعه معینی از آغازگرها (کاوشگر) برای تقویت توالی های DNA از ژنوم یا رونوشت توالی شده اشاره دارد.

تاریخچه PCR

در مقاله ای در مجله زیست شناسی مولکولی در سال 1971، کلپ و همکارانش برای اولین بار روشی را با استفاده از تجزیه و تحلیل آنزیمی برای تکثیر یک الگوی DNA کوتاه با پرایمرها در شرایط لوله آزمایش توصیف کردند. با این حال، این تجلی اولیه اصل اولیه PCR توجه زیادی را به خود جلب نکرد و اختراع واکنش زنجیره ای پلیمراز در سال 1983 به طور کلی به کری مولیس نسبت داده می شود.

زمانی که مولیس در سال 1983 PCR را توسعه داد، در امریویل، کالیفرنیا برای شرکت Cetus Corporation، یک شرکت اولیه زیست فناوری، کار می کرد. در آنجا او مسئول سنتز زنجیره های DNA کوتاه بود. مولیس نوشت که یک شب در ماشینش هنگام رانندگی در امتداد بزرگراه ساحل اقیانوس آرام، PCR را تصور کرد. زمانی که متوجه شد روشی را برای افزایش تعداد کپی هر بخش از DNA از طریق چرخه های مکرر تکراری ناشی از DNA پلیمراز ابداع کرده است، در ذهن خود روش جدیدی برای تجزیه و تحلیل تغییرات (جهش) در DNA را بازی کرد. مولیس در Scientific American این روش را خلاصه کرد: «با شروع با یک مولکول از ماده ژنتیکی DNA، PCR می‌تواند 100 میلیارد مولکول از این قبیل را در یک روز تولید کند. انجام این واکنش آسان است. به چیزی بیش از یک لوله آزمایش، چند معرف ساده و یک منبع گرما نیاز ندارد. او در سال 1993 جایزه نوبل شیمی را برای اختراع خود دریافت کرد، هفت سال بعد زمانی که او و همکارانش در Cetus برای اولین بار پیشنهاد خود را عملی کردند. با این حال، در مورد مشارکت فکری و عملی دانشمندان دیگر در کار مولیس، و اینکه آیا او تنها مخترع اصل PCR بود، اختلاف نظر وجود دارد.

روش PCR مبتنی بر استفاده از یک DNA پلیمراز مناسب است که قادر به تحمل دمای بالای 90 درجه سانتیگراد (194 درجه فارنهایت) مورد نیاز برای جدا کردن دو رشته DNA در مارپیچ دوگانه DNA پس از هر چرخه همانندسازی است. DNA پلیمرازها، که در ابتدا برای آزمایشات آزمایشگاهی مورد استفاده قرار می گرفتند، که توسط PCR پیش بینی شده بودند، قادر به تحمل چنین دماهای بالایی نبودند. بنابراین، روش‌های تکثیر DNA اولیه بسیار ناکارآمد و زمان‌بر بودند و به مقادیر زیادی DNA پلیمراز و پردازش مداوم در طول فرآیند نیاز داشتند.

کشف Taq polymerase در سال 1976، یک DNA پلیمراز جدا شده از یک باکتری گرمادوست، قمقمهآبزیانکه به طور طبیعی در محیط های گرم (50 تا 80 درجه سانتی گراد (122 تا 176 درجه فارنهایت)) مانند چشمه های آب گرم زندگی می کند، راه را برای پیشرفت چشمگیر در روش PCR هموار کرد. DNA پلیمراز جدا شده از تی.آبزیان، در دماهای بالا پایدار است و حتی پس از دناتوره شدن DNA فعال باقی می ماند، بنابراین نیازی به افزودن DNA پلیمرازهای جدید بعد از هر چرخه را از بین می برد. این امر امکان خودکارسازی فرآیند تکثیر DNA را بر اساس چرخه حرارتی فراهم کرد.

جنگ های ثبت اختراع

روش PCR پیشنهادی توسط کری مولیس ثبت شد و به شرکت Cetus که در آن مولیس هنگام اختراع این تکنیک در سال 1983 در آنجا کار می کرد، اعتبار داده شد. آنزیم Taq polymerase نیز توسط حق ثبت اختراع محافظت شده است. چندین دعوای حقوقی مطرح در رابطه با این روش وجود داشته است، از جمله یک شکایت ناموفق که توسط DuPont تنظیم شده است. شرکت داروسازی Hoffmann-La Roche در سال 1992 حقوق ثبت اختراع را به دست آورد و در حال حاضر آنهایی را که هنوز تحت حمایت هستند در اختیار دارد.

نبرد ثبت اختراع مشابه بر سر آنزیم Taq polymerase هنوز در برخی از حوزه های قضایی در سراسر جهان بین Roche و Promega ادامه دارد. استدلال های حقوقی فراتر از شرایط پتنت های اصلی PCR و Taq polymerase بود که در 28 مارس 2005 منقضی شد.

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)- روش تجربی زیست شناسی مولکولی، که تقویت ویژه اسیدهای نوکلئیک القا شده توسط آغازگرهای الیگونوکلئوتیدی مصنوعی است. درونکشتگاهی.

ایده توسعه روش PCR متعلق به محقق آمریکایی Kary Mullis است که در سال 1983 روشی را ایجاد کرد که امکان تکثیر DNA را در طی دو برابر شدن حلقوی با استفاده از آنزیم DNA پلیمراز در شرایط مصنوعی ایجاد کرد. چند سال پس از انتشار این ایده، در سال 1993، K. Mullis جایزه نوبل را برای آن دریافت کرد.

در ابتدای استفاده از روش، پس از هر چرخه گرمایش - خنک کننده، DNA پلیمراز باید به مخلوط واکنش اضافه می شد، زیرا در دمای بالا به سرعت غیرفعال می شد. این روش بسیار ناکارآمد بود و به زمان و آنزیم زیادی نیاز داشت. در سال 1986، با استفاده از DNA پلیمراز از باکتری های گرمادوست به طور قابل توجهی اصلاح شد. این آنزیم ها قادر به تحمل چرخه های واکنش زیادی هستند که به شما امکان می دهد PCR را خودکار کنید. یکی از متداول ترین DNA پلیمرازهای مقاوم در برابر حرارت از باکتری جدا شده است. ترموس آبیو نام برد طاق-DNA پلیمراز

ماهیت روش.این روش بر اساس کپی انتخابی چندگانه از یک ناحیه DNA خاص با استفاده از آنزیم Taq-DNA پلیمراز است. واکنش زنجیره ای پلیمراز به دست آوردن تقویت کننده هایی تا چندین هزار جفت باز را ممکن می سازد. برای افزایش طول محصول PCR به 20-40 هزار جفت باز، از مخلوطی از پلیمرازهای مختلف استفاده می شود، اما هنوز هم بسیار کمتر از طول DNA کروموزومی یک سلول یوکاریوتی است.

واکنش در یک ترموستات قابل برنامه ریزی (تقویت کننده) انجام می شود - دستگاهی که می تواند به اندازه کافی سریع انجام دهد.

خنک کردن و گرم کردن لوله های آزمایش (معمولاً با دقت حداقل 0.1 درجه سانتیگراد). آمپلی فایرها به شما امکان می دهند برنامه های پیچیده ای را تنظیم کنید، از جمله برنامه هایی که امکان "شروع داغ" و ذخیره سازی بعدی را دارند. برای PCR بلادرنگ، دستگاه هایی مجهز به آشکارساز فلورسنت تولید می شوند. ابزارها همچنین با درب اتوماتیک و محفظه میکروپلیت در دسترس هستند که به آنها اجازه می دهد در سیستم های خودکار ادغام شوند.

معمولاً در طی PCR، 20-45 سیکل انجام می شود که هر یک از سه مرحله دناتوراسیون، بازپخت پرایمر، طویل شدن (شکل 6.1 و 6.2) تشکیل شده است. روی انجیر 6.1 دینامیک تغییرات دما در لوله آزمایش را در طول چرخه PCR نشان می دهد.

برنج. 6.1.نمودار تغییر دما در لوله آزمایش در طی یک چرخه واکنش زنجیره ای پلیمراز

دناتوره شدن الگوی DNAبا حرارت دادن مخلوط واکنش به 94-96 درجه سانتیگراد به مدت 5-90 ثانیه انجام می شود تا زنجیره های DNA پراکنده شوند. لازم به ذکر است که قبل از چرخه اول، مخلوط واکنش به مدت 2 تا 5 دقیقه از قبل گرم می شود تا ماتریس اولیه به طور کامل دناتوره شود، که امکان کاهش مقدار محصولات واکنش غیر اختصاصی را فراهم می کند.

برنج. 6.2.طرح چرخه اول واکنش زنجیره ای پلیمراز

مرحله بازپخت پرایمر.با کاهش تدریجی دما، پرایمرها به طور مکمل به قالب متصل می شوند. دمای بازپخت به ترکیب پرایمرها بستگی دارد و معمولاً 4-5 درجه سانتیگراد کمتر از دمای ذوب محاسبه شده است. مدت زمان مرحله 5-60 ثانیه است.

در مرحله بعدی - طویل شدن- سنتز رشته دختری DNA روی ماتریکس مادری وجود دارد. دمای ازدیاد طول بستگی به پلیمراز دارد. DNA پلیمرازهای متداول Taq و Pfu در دمای 72 درجه سانتیگراد فعال هستند. زمان ازدیاد طول، عمدتاً به طول محصول PCR بستگی دارد، معمولاً 1 دقیقه در هر 1000 جفت باز است.

آژانس فدرال آموزش

موسسه آموزشی دولتی

آموزش عالی حرفه ای

"آکادمی آموزشی دولتی کارلیان"

کار درسی با موضوع:

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) و کاربرد آن

تکمیل شده توسط: دانش آموز Koryagina Valeria Alexandrovna

بررسی شده توسط: کارپیکووا ناتالیا میخایلوونا

پتروزاوودسک 2013

معرفی

فصل 1 بررسی ادبیات

1.5.4 افکت فلات

1.5.6 تقویت

نتیجه

معرفی

بیست سال گذشته با معرفی گسترده روش های ژنتیک مولکولی در علوم زیستی، پزشکی و کشاورزی مشخص شده است.

در اوایل دهه 1970، به نظر می رسید که زیست شناسی مولکولی به درجه خاصی از کمال رسیده است. در این دوره، میکروارگانیسم ها موضوع اصلی تحقیقات ژنتیک مولکولی بودند. انتقال به یوکاریوت ها مشکلات کاملاً جدیدی را برای محققان ایجاد کرد که با استفاده از روش های تجزیه و تحلیل ژنتیکی موجود در آن زمان قابل حل نبود. پیشرفت در توسعه ژنتیک مولکولی به دلیل ظهور یک ابزار آزمایشی جدید - اندونوکلئازهای محدود امکان پذیر شد. در سال‌های بعد، تعداد روش‌های آنالیز DNA مستقیم بر اساس رویکردهای کیفی متفاوت به سرعت شروع به افزایش کرد.

در بسیاری از موارد، فن‌آوری‌های مدرن این امکان را فراهم کرده‌اند که مطالعه ساختار ساختاری و عملکردی ژنوم‌های هسته‌ای و خارج هسته‌ای موجودات مختلف را در سطح عمیق‌تری آغاز کنیم. این امر برای توسعه روش های جدید تشخیص و درمان از اهمیت ویژه ای برخوردار بود. بیماری های مختلف. امکان استفاده از دستاوردهای ژنتیک مولکولی در زیست‌شناسی و اصلاح نژاد جمعیت برای شناسایی و تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی جمعیت‌ها، گونه‌ها و سویه‌ها، شناسایی و تایید افراد با ارزش اقتصادی، ایجاد ارگانیسم‌های اصلاح‌شده ژنتیکی و حل مسائل دیگر کم اهمیت نبود.

هر روشی مزایا و معایب خاص خود را دارد. نه روش جهانی، که می تواند تمام مشکلات پیش آمده را حل کند. بنابراین انتخاب روشی خاص برای تحقیق در حال انجام یکی از مهمترین مراحل هر کار علمی است.

فصل 1 بررسی ادبیات

1.1 تاریخچه کشف واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)

در سال 1983 ک.ب. Mullis و همکاران روش واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) را منتشر و ثبت اختراع کردند که قرار بود تأثیر عمیقی بر تمام زمینه های تحقیق و کاربرد اسیدهای نوکلئیک داشته باشد. اهمیت این روش برای زیست شناسی مولکولی و ژنتیک به قدری آشکار و آشکار شد که هفت سال بعد نویسنده جایزه نوبل شیمی را دریافت کرد.

در ابتدای استفاده از روش، پس از هر چرخه گرمایش و خنک‌کننده، DNA پلیمراز باید به مخلوط واکنش اضافه می‌شد، زیرا در دمای بالا که برای جداسازی زنجیره‌های مارپیچ DNA غیرفعال می‌شد، غیرفعال می‌شد. روش واکنش نسبتاً ناکارآمد بود و به زمان و آنزیم زیادی نیاز داشت. در سال 1986، روش واکنش زنجیره ای پلیمراز به طور قابل توجهی بهبود یافت. پیشنهاد شده است از DNA پلیمرازهای باکتری های گرمادوست استفاده شود. ثابت شد که این آنزیم ها در برابر حرارت پایدار هستند و می توانند چرخه های واکنش زیادی را تحمل کنند. استفاده از آنها امکان ساده سازی و خودکارسازی PCR را فراهم کرد. یکی از اولین DNA پلیمرازهای مقاوم در برابر حرارت از باکتری جدا شد ترموس آبیو نام برد طاق-پلیمراز

امکان تکثیر هر قطعه DNA که توالی نوکلئوتیدی آن مشخص است و به دست آوردن آن پس از اتمام PCR به صورت همگن و به مقدار آماده سازی باعث انجام PCR می شود. روش جایگزینشبیه سازی مولکولی قطعات کوتاه DNA در این مورد، نیازی به استفاده از تکنیک های روش شناختی پیچیده ای نیست که در مهندسی ژنتیک در شبیه سازی معمولی استفاده می شود. توسعه روش PCR امکانات روش‌شناختی ژنتیک مولکولی و به‌ویژه مهندسی ژنتیک را بسیار گسترش داده است، به طوری که پتانسیل علمی بسیاری از حوزه‌های آن را به‌طور اساسی تغییر داده و تقویت کرده است.

1.2 انواع واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)

· Nested PCR- برای کاهش تعداد محصولات جانبی واکنش استفاده می شود. از دو جفت پرایمر استفاده کنید و دو واکنش متوالی انجام دهید. جفت دوم پرایمر ناحیه DNA را در محصول واکنش اول تقویت می کند.

· PCR معکوس- زمانی استفاده می شود که فقط یک ناحیه کوچک در توالی مورد نظر شناخته شده باشد. این روش به ویژه زمانی مفید است که تعیین توالی های همسایه پس از درج DNA در ژنوم ضروری باشد. برای اجرای PCR معکوس، یک سری برش DNA با آنزیم های محدود کننده انجام می شود<#"justify">آغازگر واکنش زنجیره ای پلیمراز

· PCR مخصوص گروه- PCR برای بستگان<#"center">1.3 واکنش زنجیره ای پلیمراز

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) که در اواسط دهه 1980 کشف شد، می‌تواند تعداد کپی‌های یک نمونه اصلی را در عرض چند ساعت میلیون‌ها بار افزایش دهد. در طول هر چرخه واکنش، دو نسخه از مولکول اصلی تشکیل می شود. هر یک از کپی های DNA سنتز شده می تواند به عنوان الگویی برای سنتز نسخه های DNA جدید در چرخه بعدی عمل کند. بنابراین، تکرار مکرر چرخه ها منجر به افزایش تصاعدی تعداد کپی ها می شود. از محاسبات چنین بر می آید که حتی اگر 30 چرخه وجود داشته باشد، تعداد کپی های مولکول اصلی بیش از 1 میلیارد خواهد بود. حتی اگر در نظر بگیریم که همه آمپلیکون ها در هر چرخه کپی نمی شوند، با وجود این، تعداد کل کپی ها رقم بسیار زیادی است.

هر چرخه واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) شامل مراحل زیر است:

· دناتوره شدن - افزایش دما باعث می شود یک مولکول DNA دو رشته ای باز شود و به دو تک رشته تقسیم شود.

· بازپخت - کاهش دما به پرایمرها اجازه می دهد تا به مناطق مکمل مولکول DNA بچسبند.

· ازدیاد طول - آنزیم DNA پلیمراز رشته مکمل را تکمیل می کند.

برای تکثیر قطعه انتخاب شده، از دو آغازگر اولیگونوکلئوتیدی (دانه) که در کنار یک ناحیه DNA خاص قرار دارند استفاده می شود. پرایمر گرا 3 - به سمت یکدیگر و در جهت دنباله ای که نیاز به تقویت دارد به پایان می رسد. DNA پلیمراز سنتز (تکمیل) زنجیره های DNA مکمل متقابل را انجام می دهد و با آغازگرها شروع می شود. در طول سنتز DNA، پرایمرها به صورت فیزیکی در زنجیره مولکول های DNA تازه سنتز شده قرار می گیرند. هر رشته از مولکول DNA که با استفاده از یکی از آغازگرها تشکیل می شود، می تواند به عنوان الگویی برای سنتز یک رشته DNA مکمل با استفاده از آغازگر دیگر عمل کند.

1.4 انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)

واکنش زنجیره ای پلیمراز در لوله های آزمایش پلی پروپیلن جدار نازک ویژه انجام می شود که از نظر اندازه با سیکلر حرارتی مورد استفاده (تقویت کننده) سازگار است - دستگاهی که مشخصات دما و زمان مراحل واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) را کنترل می کند. .

1.5 اصل روش واکنش زنجیره ای پلیمراز

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) یک روش تقویت DNA در شرایط آزمایشگاهی است که می تواند یک توالی DNA خاص را در عرض چند ساعت میلیاردها بار جدا و تکثیر کند. توانایی به دست آوردن تعداد زیادی کپی از یک منطقه کاملاً تعریف شده از ژنوم مطالعه یک نمونه DNA موجود را بسیار ساده می کند.

برای انجام یک واکنش زنجیره ای پلیمراز، تعدادی شرایط باید رعایت شود:

1.5.1 وجود تعدادی از اجزاء در مخلوط واکنش

اجزای اصلی مخلوط واکنش (PCR) عبارتند از: Tris-HCl، KCl، MgCl. 2، مخلوطی از تری فسفات های نوکلئوتیدی (ATP، GTP، CTP، TTP)، آغازگرها (الیگونوکلئوتیدها)، آماده سازی DNA تجزیه شده، DNA پلیمراز پایدار در برابر حرارت. هر یک از اجزای مخلوط واکنش مستقیماً در واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) نقش دارند و غلظت معرف ها مستقیماً بر روند تقویت تأثیر می گذارد.

· Tris-HCl - pH مخلوط واکنش را تعیین می کند، ظرفیت بافر ایجاد می کند. فعالیت DNA پلیمراز به pH محیط بستگی دارد، بنابراین مقدار pH مستقیماً بر روند واکنش زنجیره ای پلیمراز تأثیر می گذارد. معمولا مقدار pH در محدوده 8 - 9.5 است. PH بالا به این دلیل است که با افزایش دما، pH بافر Tril-HCl کاهش می یابد.

· KCl - غلظت کلرید پتاسیم تا 50 میلی متر بر روند فرآیندهای دناتوره سازی و بازپخت تأثیر می گذارد ، غلظت بالای 50 میلی متر DNA پلیمراز را مهار می کند.

· MgCl 2- چون DNA پلیمراز منیزیم است 2+- آنزیم وابسته، سپس غلظت یون منیزیم بر فعالیت آنزیم تأثیر می گذارد (Mg 2+کمپلکس هایی را با NTP تشکیل می دهد - این مجتمع ها هستند که بستر پلیمراز هستند). غلظت بالا منجر به افزایش در تقویت غیر اختصاصی می شود و غلظت کم منجر به مهار واکنش می شود، بهینه (برای پلیمرازهای مختلف) در ناحیه 0.5 - 5 میلی مولار است. علاوه بر این، غلظت نمک های منیزیم بر روند دناتوره شدن و فرآیندهای بازپخت تأثیر می گذارد - افزایش غلظت Mg. 2+باعث افزایش دمای ذوب DNA می شود (یعنی دمایی که در آن 50 درصد رشته های DNA دو رشته ای به رشته های تک رشته ای شکسته می شوند).

· NTP - نوکلئوتید تری فسفات ها مونومرهای مستقیم اسیدهای نوکلئیک هستند. برای جلوگیری از خاتمه زنجیره، نسبت مساوی از هر چهار نوکلئوتید تری فسفات توصیه می شود. غلظت کم این اجزا در مخلوط واکنش، احتمال خطا در ساخت رشته DNA مکمل را افزایش می دهد.

· آغازگرها - بهینه ترین استفاده از آغازگرهایی با اختلاف نقطه ذوب حداکثر 2 - 4 است. o ج- گاهی در زمان نگهداری طولانی مدت در دمای 4 o با، یا پس از تعداد زیادی انجماد - ذوب، پرایمرها ساختارهای ثانویه - دایمرها را تشکیل می دهند و کارایی PCR را کاهش می دهند. رفع این مشکل به انکوباسیون در حمام آب کاهش می یابد (T=95 o ج) به مدت 3 دقیقه و سپس خنک شدن سریع تا 0o از جانب.

· آماده سازی DNA - کمیت و کیفیت آماده سازی DNA (ماتریس) به طور مستقیم بر روند و پارامترهای واکنش زنجیره ای پلیمراز تأثیر می گذارد. نمونه DNA اضافی واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) را مهار می کند. ناخالصی های مواد مختلف در آماده سازی DNA نیز می تواند کارایی واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) را کاهش دهد: استات سدیم، کلرید سدیم، ایزوپروپانول، اتانول، هپارین، فنل، اوره، هموگلوبین و غیره.

· DNA پلیمراز - هنگام استفاده از مقدار کمی DNA پلیمراز، کاهش سنتز محصول نهایی به نسبت مستقیم با اندازه قطعات مشاهده می شود. بیش از 2 تا 4 برابر پلیمراز منجر به ظهور طیف های منتشر و 4 تا 16 برابر - طیف های غیر اختصاصی با وزن مولکولی کم می شود. محدوده غلظت مورد استفاده 0.5 - 1.5 واحد فعالیت بر حسب 25 میکرولیتر از مخلوط PCR است.

علاوه بر اجزای اصلی مخلوط PCR، تعدادی از مواد اضافی استفاده می شود که شاخص های کیفی و کمی PCR را بهبود می بخشد: استامید (5٪) - افزایش حلالیت اجزای اصلی. بتائین ( نمک سدیم) - تثبیت DNA پلیمراز، کاهش نقطه ذوب DNA، برابر کردن نقطه ذوب. آلبومین گاوی (10-100 میکروگرم در میلی لیتر) - تثبیت DNA پلیمراز. دی متیل سولفوکسید (1-10٪) - افزایش حلالیت اجزای اصلی. فرمامید (2-10٪) - افزایش ویژگی بازپخت. گلیسرول (15-20٪) - افزایش پایداری حرارتی آنزیم، کاهش دمای دناتوراسیون نمونه DNA. سولفات آمونیوم - کاهش دمای دناتوره شدن و بازپخت شدن.

1.5.2 چرخه و دما

نمای کلی برنامه واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) به شرح زیر است:

صحنه. دناتوراسیون اولیه طولانی مدت آماده سازی DNA. چرخه 1

صحنه. دناتوره شدن سریع آماده سازی DNA. آنیل پرایمر. ازدیاد طول.30 - 45 چرخه.

صحنه. طویل شدن طولانی مدت. خنک شدن مخلوط واکنش 1 سیکل.

هر عنصر مرحله - دناتوراسیون، بازپخت، ازدیاد طول - دارای ویژگی های دمایی و زمانی فردی است. پارامترهای دما و زمان جریان هر عنصر به صورت تجربی و مطابق با شاخص های کمی و کیفی محصولات تقویت انتخاب می شوند.

دناتوره سازی. در طی این عنصر از واکنش زنجیره ای پلیمراز، یک مولکول DNA دو رشته ای به دو تک رشته ای تقسیم می شود. پارامترهای دمایی دناتوراسیون در محدوده 90 - 95 می باشد o ج، اما در مورد نمونه DNA با محتوای عالیگوانین و سیتوزین، درجه حرارت باید به 98 افزایش یابد o ج- دمای دناتوره شدن باید برای دناتوره شدن کامل کافی باشد - رشته های DNA را شکافت و از "سرد شدن ناگهانی" یا بازپخت سریع اجتناب کرد، با این حال، DNA پلیمراز مقاوم در برابر حرارت در دماهای بالا پایداری کمتری دارد. بنابراین، انتخاب پارامترهای دمای دناتوراسیون بهینه برای نسبت پرایمر به نمونه (تهیه DNA) یک شرط مهم برای تقویت است. اگر دمای دناتوراسیون در مرحله اول بالای 95 باشد o C، توصیه می شود پس از دناتوراسیون اولیه، DNA پلیمراز را به مخلوط واکنش اضافه کنید. مدت زمان این عنصر مرحله در طی واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) باید برای دناتوره شدن کامل DNA کافی باشد، اما در عین حال تأثیر قابل توجهی بر فعالیت DNA پلیمراز در دمای معین ندارد.

آنیل کردن. دمای بازپخت (T ولی ) یکی از مهمترین پارامترهای واکنش زنجیره ای پلیمراز است. دمای بازپخت برای هر آغازگر خاص به صورت جداگانه انتخاب می شود. این بستگی به طول و ترکیب نوکلئوتیدی پرایمر دارد. معمولاً 2 - 4 کمتر است o از مقدار نقطه ذوب (T متر ) آغازگر. اگر دمای بازپخت سیستم کمتر از حد مطلوب باشد، تعداد قطعات تقویت‌شده غیر اختصاصی افزایش می‌یابد و برعکس، بیشتر می‌شود. حرارتمقدار محصولات تقویت شده را کاهش می دهد. در این حالت، غلظت آمپلیکون‌های خاص می‌تواند به شدت کاهش یابد تا از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) جلوگیری شود. افزایش زمان بازپخت همچنین منجر به افزایش تعداد آمپلیکن های غیر اختصاصی می شود.

ازدیاد طول. به طور معمول، هر نوع از DNA پلیمراز پایدار در برابر حرارت دارای یک فعالیت بهینه دمایی جداگانه است. سرعت سنتز یک رشته DNA مکمل توسط یک آنزیم نیز مقداری خاص برای هر پلیمراز است (به طور متوسط 30-60 نوکلئوتید در ثانیه یا 1-2 هزار باز در دقیقه) بنابراین زمان افزایش طول بسته به آن انتخاب می شود. در مورد نوع DNA پلیمراز و طول ناحیه تقویت شده.

1.5.3 اصول اولیه انتخاب پرایمر

هنگام ایجاد یک سیستم آزمایش PCR، یکی از وظایف اصلی انتخاب صحیح پرایمرهایی است که باید تعدادی از معیارها را برآورده کنند:

پرایمرها باید خاص باشند. توجه ویژهپرداخت 3 - انتهای آغازگرها، زیرا از آنهاست که Taq پلیمراز شروع به تکمیل زنجیره DNA مکمل می کند. اگر ویژگی آنها ناکافی باشد، احتمالاً فرآیندهای نامطلوبی در لوله آزمایش با مخلوط واکنش رخ می دهد، یعنی سنتز DNA غیر اختصاصی (قطعات کوتاه یا بلند). در الکتروفورز به شکل نوارهای اضافی سنگین یا سبک قابل مشاهده است. این امر ارزیابی نتایج واکنش را دشوار می کند، زیرا به راحتی می توان یک محصول تقویتی خاص را با DNA خارجی سنتز شده اشتباه گرفت. بخشی از پرایمرها و dNTP ها برای سنتز DNA غیر اختصاصی مصرف می شود که منجر به کاهش قابل توجه حساسیت می شود.

پرایمرها نباید دایمر و حلقه تشکیل دهند، یعنی. هیچ رشته دوتایی پایدار نباید با بازپخت پرایمرها به خود یا به یکدیگر تشکیل شود.

1.5.4 افکت فلات

لازم به ذکر است که فرآیند انباشتگی محصولات تقویتی خاص به صورت تصاعدی تنها مدت زمان محدودی طول می کشد و سپس بازده آن به شدت کاهش می یابد. این به دلیل به اصطلاح اثر "فلات" است.

اثر مدت فلات برای توصیف فرآیند تجمع محصولات PCR در آخرین چرخه های تقویت استفاده می شود.

بسته به شرایط و تعداد چرخه های واکنش تقویت، در زمانی که اثر حاصل می شود فلات استفاده از سوبستراها (dNTP ها و پرایمرها)، پایداری واکنش دهنده ها (dNTPs و آنزیم)، تعداد بازدارنده ها، از جمله پیروفسفات ها و DNA دوبلکس، رقابت برای واکنش دهنده ها با محصولات غیر اختصاصی یا پرایمر-دایمرها، غلظت یک محصول خاص. و دناتوره شدن ناقص در غلظت های بالای محصولات تقویتی.

هر چه غلظت اولیه DNA هدف کمتر باشد، خطر واکنش بیشتر است این نقطه می تواند قبل از اینکه تعداد محصولات تقویتی خاص برای تجزیه و تحلیل کافی باشد رخ دهد. فقط سیستم های آزمایشی بهینه شده می توانند از این امر جلوگیری کنند.

1.5.5 آماده سازی نمونه از مواد بیولوژیکی

بسته به وظایف، تکنیک های مختلفی برای استخراج DNA استفاده می شود. ماهیت آنها در استخراج (استخراج) DNA از یک محصول بیولوژیکی و حذف یا خنثی سازی ناخالصی های خارجی برای به دست آوردن یک آماده سازی DNA با خلوص مناسب برای PCR است.

روش به دست آوردن یک آماده سازی DNA خالص که توسط Marmur شرح داده شده است، استاندارد در نظر گرفته می شود و قبلاً کلاسیک شده است. این شامل پروتئولیز آنزیمی و به دنبال آن پروتئین زدایی و رسوب مجدد DNA با الکل است. این روش به دست آوردن یک آماده سازی DNA خالص را ممکن می سازد. با این حال، بسیار پر زحمت است و شامل کار با مواد تهاجمی و تند مانند فنل و کلروفرم است.

یکی از روش های رایج در حال حاضر، روش استخراج DNA است که توسط بوم و همکاران پیشنهاد شده است. این روش مبتنی بر استفاده از یک عامل آشوب‌گردان قوی، گوانیدین تیوسیانات (GuSCN) برای لیز سلولی و جذب DNA بعدی بر روی یک حامل (دانه‌های شیشه‌ای، خاک دیاتومه، شیر شیشه‌ای و غیره) است. پس از شستشو، DNA در نمونه جذب شده بر روی حامل باقی می ماند، که می توان آن را به راحتی با استفاده از یک بافر شستشو از آن جدا کرد. این روش راحت، از نظر فناوری پیشرفته و مناسب برای آماده سازی نمونه برای تقویت است. با این حال، از دست دادن DNA به دلیل جذب غیرقابل برگشت در حامل و همچنین در طول شستشوهای متعدد امکان پذیر است. بخصوص پراهمیتاین در هنگام کار با مقادیر کمی از DNA در یک نمونه است. علاوه بر این، حتی مقادیر کمی از GuSCN می تواند PCR را مهار کند. بنابراین، هنگام استفاده از این روش، بسیار مهم است انتخاب صحیحجاذب و رعایت دقیق تفاوت های ظریف تکنولوژیکی.

گروه دیگری از روش‌های آماده‌سازی نمونه مبتنی بر استفاده از مبدل‌های یونی نوع Chilex است که برخلاف شیشه، DNA را جذب نمی‌کند، بلکه ناخالصی‌هایی را که در واکنش تداخل دارند، جذب می‌کنند. به عنوان یک قاعده، این فناوری شامل دو مرحله است: جوشاندن نمونه و جذب ناخالصی ها در مبدل یونی. این روش به دلیل سادگی اجرا بسیار جذاب است. در بیشتر موارد، برای کار با مواد بالینی مناسب است. متأسفانه، گاهی اوقات نمونه هایی با ناخالصی وجود دارد که با استفاده از مبدل های یونی قابل حذف نیستند. علاوه بر این، برخی از میکروارگانیسم ها را نمی توان با جوشاندن ساده از بین برد. در این موارد لازم است مراحل تکمیلی پردازش نمونه معرفی شود.

بنابراین، انتخاب روش آماده‌سازی نمونه باید با درک اهداف تحلیل‌های مورد نظر مورد بررسی قرار گیرد.

1.5.6 تقویت

برای انجام واکنش تقویت، لازم است مخلوط واکنش آماده شود و نمونه DNA آنالیز شده به آن اضافه شود. در این مورد، مهم است که برخی از ویژگی های آنیل پرایمر را در نظر بگیرید. واقعیت این است که، به عنوان یک قاعده، در نمونه بیولوژیکی تجزیه و تحلیل شده، مولکول های DNA مختلفی وجود دارد که آغازگرهای مورد استفاده در واکنش دارای همسانی جزئی و در برخی موارد قابل توجه هستند. علاوه بر این، پرایمرها می توانند به یکدیگر بازپخت شوند تا پرایمر-دایمرها را تشکیل دهند. هر دو منجر به مصرف قابل توجه پرایمرها برای سنتز محصولات واکنش جانبی (غیر اختصاصی) می شوند و در نتیجه حساسیت سیستم را به میزان قابل توجهی کاهش می دهند. این امر خواندن نتایج واکنش را در طول الکتروفورز دشوار یا غیرممکن می کند.

1.6 ترکیب مخلوط واکنش استاندارد PCR

x بافر PCR (محلول 100 میلی مولار Tris-HCl، pH 9.0، محلول KCl 500 میلی مولار، محلول MgCl2 25 میلی مولار ) …….2.5 µl

آب (MilliQ) ………………………………………………….18.8 µl

مخلوطی از نوکلئوتید تری فسفات (dNTPs)

mM محلول هر…………………………………………………….0.5 µl

پرایمر 1 (محلول 10 میلی مولار) ……………………………………………….۱ µl

پرایمر 2 (محلول 10 میلی مولار) ……………………………………………….1 µl

DNA پلیمراز (5 واحد در میکرولیتر) ………………………………………………………………………………………………………

نمونه DNA (20 نانوگرم در میکرولیتر) …………………………………………………………..1 µl

1.7 ارزیابی نتایج واکنش

به منظور ارزیابی صحیح نتایج PCR، درک این نکته مهم است که این روش کمی نیست. از نظر تئوری، محصولات تکثیر مولکول‌های DNA هدف را می‌توان با الکتروفورز پس از 30-35 چرخه شناسایی کرد. با این حال، در عمل این کار فقط در مواردی انجام می شود که واکنش در شرایط نزدیک به ایده آل اتفاق می افتد، که اغلب در زندگی با آن مواجه نمی شود. درجه خلوص آماده سازی DNA تأثیر زیادی بر کارایی تقویت دارد. وجود برخی بازدارنده ها در مخلوط واکنش که در برخی موارد خلاص شدن از شر آنها بسیار دشوار است. گاهی اوقات به دلیل وجود آنها، نمی توان حتی ده ها هزار مولکول DNA هدف را تقویت کرد. بنابراین، اغلب هیچ رابطه مستقیمی بین مقدار اولیه DNA هدف و مقدار نهایی محصولات تقویت وجود ندارد.

فصل 2: کاربردهای واکنش زنجیره ای پلیمراز

PCR در بسیاری از زمینه ها برای تجزیه و تحلیل و در آزمایش های علمی استفاده می شود.

جرم شناسی

PCR برای مقایسه به اصطلاح "اثر انگشت ژنتیکی" استفاده می شود. به یک نمونه ماده ژنتیکی از محل جنایت - خون، بزاق، مایع منی، مو و ... نیازمندیم. با مواد ژنتیکی مظنون مقایسه می شود. مقدار بسیار کمی از DNA کافی است، از نظر تئوری - یک کپی. DNA به قطعات بریده می شود، سپس با PCR تکثیر می شود. قطعات با الکتروفورز DNA جدا می شوند. تصویر حاصل از محل باندهای DNA اثر انگشت ژنتیکی نامیده می شود.

ایجاد پدری

نتایج الکتروفورز قطعات DNA تکثیر شده توسط PCR. پدر کودک. مادر. کودک برخی از ویژگی های ردپای ژنتیکی هر دو والدین را به ارث برد که اثری جدید و منحصر به فرد ایجاد کرد.

اگرچه "اثر انگشت ژنتیکی" منحصر به فرد است، اما هنوز هم می توان با ایجاد چندین اثر انگشت از این دست پیوندهای خانوادگی برقرار کرد. همین روش را می توان با تغییرات جزئی برای ایجاد روابط تکاملی بین موجودات به کار برد.

تشخیص پزشکی

PCR امکان تسریع و تسهیل قابل توجه تشخیص ارثی و بیماری های ویروسی. ژن مورد نظر توسط PCR با استفاده از پرایمرهای مناسب تکثیر شده و سپس برای تعیین جهش ها توالی یابی می شود. عفونت های ویروسیبلافاصله پس از عفونت، هفته ها یا ماه ها قبل از ظاهر شدن علائم بیماری قابل تشخیص است.

پزشکی شخصی

گاهی اوقات داروها برای برخی از بیماران سمی یا حساسیت زا هستند. دلایل این امر تا حدی در تفاوت های فردی در حساسیت و متابولیسم داروها و مشتقات آنها است. این تفاوت ها در سطح ژنتیکی مشخص می شود. به عنوان مثال، در یک بیمار، یک سیتوکروم خاص ممکن است فعال تر باشد، در دیگری - کمتر. به منظور تعیین نوع سیتوکروم یک بیمار، پیشنهاد می شود قبل از استفاده از دارو، آنالیز PCR انجام شود. این تجزیه و تحلیل ژنوتیپ اولیه نامیده می شود.

شبیه سازی ژن

شبیه سازی ژن، فرآیند جداسازی ژن ها و در نتیجه دستکاری های مهندسی ژنتیک، به دست آوردن مقدار زیادی از محصول یک ژن است. PCR برای تکثیر یک ژن استفاده می‌شود، که سپس در یک ناقل، قطعه‌ای از DNA که ژن خارجی را به همان ارگانیسم یا ارگانیسم دیگری که رشد آسان دارد، وارد می‌شود. به عنوان ناقل، به عنوان مثال، پلاسمیدها یا DNA ویروسی استفاده می شود. قرار دادن ژن ها در یک ارگانیسم خارجی معمولاً برای به دست آوردن محصول این ژن - RNA یا اغلب یک پروتئین استفاده می شود. بنابراین بسیاری از پروتئین ها در مقادیر صنعتی برای استفاده در کشاورزی، پزشکی و غیره به دست می آیند.

توالی یابی DNA

PCR بخشی جدایی ناپذیر از روش توالی یابی با استفاده از دی اکسی نوکلئوتیدهای نشاندار شده با یک برچسب فلورسنت یا یک ایزوتوپ رادیواکتیو است، زیرا در طول پلیمریزاسیون است که مشتقات نوکلئوتیدهای نشاندار شده با برچسب فلورسنت یا رادیواکتیو به زنجیره DNA وارد می شوند. این واکنش را متوقف می کند، و اجازه می دهد تا موقعیت نوکلئوتیدهای خاص پس از جداسازی رشته های سنتز شده در ژل تعیین شود.

جهش زایی

در حال حاضر PCR به روش اصلی جهش زایی تبدیل شده است. استفاده از PCR امکان ساده‌سازی و تسریع فرآیند جهش‌زایی و همچنین قابل اطمینان‌تر کردن و تکرارپذیری بیشتر آن را فراهم کرد.

روش PCR امکان تجزیه و تحلیل وجود توالی‌های ویروس پاپیلومای انسانی را در بخش‌های بیوپسی نئوپلاسم‌های دهانه رحم انسان تعبیه‌شده در پارافین 40 سال قبل از این مطالعه فراهم کرد. علاوه بر این، با کمک PCR، تکثیر و شبیه سازی قطعات DNA میتوکندری از بقایای فسیلی مغز انسان 7 هزار ساله امکان پذیر شد!

توانایی تجزیه و تحلیل همزمان دو جایگاه واقع در کروموزوم‌های غیرهمولوگ مختلف بر روی لیزات اسپرم‌های فردی انسان نشان داده شد. این رویکرد فراهم می کند فرصت منحصر به فردتجزیه و تحلیل ژنتیکی خوب و مطالعه نوترکیبی کروموزومی، پلی‌مورفیسم DNA و غیره. روش تجزیه و تحلیل اسپرم‌های منفرد فوراً در پزشکی قانونی کاربرد عملی پیدا کرد، زیرا تایپ HLA سلول‌های هاپلوئید به شما امکان می‌دهد پدری را تعیین کنید یا یک جنایتکار را شناسایی کنید (مجموعه HLA یک جنایت است. مجموعه‌ای از ژن‌های مجتمع اصلی سازگاری بافتی انسان؛ جایگاه‌های کمپلکس HLA، چندشکلی‌ترین مکان‌های شناخته شده در مهره‌داران عالی هستند: در یک گونه، در هر مکان، تعداد غیرمعمول زیادی از آلل‌های مختلف وجود دارد - اشکال جایگزین همان ژن).

با استفاده از PCR می توان صحت ادغام ساختارهای ژنتیکی خارجی را در ناحیه از پیش تعیین شده ژنوم سلول های مورد مطالعه آشکار کرد. DNA کل سلولی با دو آغازگر اولیگونوکلئوتیدی بازپخت می‌شود که یکی از آنها مکمل ناحیه DNA میزبان در نزدیکی نقطه درج است و دیگری برای توالی قطعه یکپارچه در رشته DNA ضد موازی. واکنش زنجیره ای پلیمراز در مورد ساختار بدون تغییر DNA کروموزومی در محل درج پیشنهادی منجر به تشکیل قطعات DNA تک رشته ای با اندازه نامحدود می شود، و در مورد درج برنامه ریزی شده، قطعات DNA دو رشته ای یک شناخته شده اندازه، با فاصله بین محل های بازپخت دو آغازگر تعیین می شود. علاوه بر این، درجه تقویت ناحیه مورد تجزیه و تحلیل ژنوم در مورد اول به صورت خطی به تعداد چرخه ها و در مورد دوم به صورت نمایی بستگی دارد. تجمع نمایی یک قطعه تقویت شده با اندازه از پیش تعیین شده در طی PCR امکان مشاهده بصری آن را پس از تقسیم الکتروفورتیک یک آماده سازی DNA و نتیجه گیری بدون ابهام در مورد قرار دادن یک توالی خارجی در یک منطقه معین از DNA کروموزومی فراهم می کند.

نتیجه

روش PCR در حال حاضر بیشترین کاربرد را به عنوان روشی برای تشخیص انواع بیماری های عفونی دارد. PCR به شما امکان می دهد تا علت عفونت را شناسایی کنید، حتی اگر نمونه گرفته شده برای تجزیه و تحلیل فقط حاوی چند مولکول DNA از پاتوژن باشد. PCR به طور گسترده ای در تشخیص زودهنگامعفونت های HIV هپاتیت ویروسیو غیره. تا به امروز، تقریبا هیچ عامل عفونی وجود ندارد که با استفاده از PCR قابل تشخیص نباشد.

فهرست ادبیات استفاده شده

1.Padutov V.E.، Baranov O.Yu.، Voropaev E.V. روشهای آنالیز مولکولی - ژنتیکی. - Minsk: Unipol, 2007. - 176 p.

2.PCR "در زمان واقعی" / Rebrikov D.V.، Samatov G.A.، Trofimov D.Yu. و غیره.؛ ویرایش ب n D.V. ریبریکوف; پیشگفتار L.A. اوسترمن و آکادمی. RAS و RAAS E.D. Sverdlov; ویرایش دوم، برگردان و اضافی - M.: BINOM. آزمایشگاه دانش، 1388. - 223 ص.

.پاتروشف L.I. سیستم های ژنتیکی مصنوعی - M.: Nauka، 2005. - در 2 تن

.ب. گلیک، جی پاسترناک بیوتکنولوژی مولکولی. اصول و کاربرد 589 صفحه، 2002

5.شچلکونوف S.N. مهندسی ژنتیک. - نووسیبیرسک: سیب. دانشگاه انتشارات، 2004. - 496 ص.

ویرایش شده توسط A.A. ووربیوا "واکنش زنجیره ای پلیمراز و کاربرد آن برای تشخیص در درماتوونرولوژی". خبرگزاری پزشکی - 72 صفحه

Http://ru. wikipedia.org

http://scholar. google.ru

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. سو/ - مجله پزشکی

تدریس خصوصی

برای یادگیری یک موضوع به کمک نیاز دارید؟

کارشناسان ما در مورد موضوعات مورد علاقه شما مشاوره یا خدمات آموزشی ارائه خواهند داد.
درخواست ارسال کنیدنشان دادن موضوع در حال حاضر برای اطلاع از امکان اخذ مشاوره.

اصل روش (مبنای بیولوژیکی مولکولی)

در میان طیف گسترده ای از روش های هیبریداسیون برای آنالیز DNA، روش PCR بیشترین استفاده را در تشخیص آزمایشگاهی بالینی دارد.

اصل روش واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)(واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)) توسط کری مولیس (Cetus، ایالات متحده آمریکا) در سال 1983 توسعه یافت. و در حال حاضر به طور گسترده هم برای تحقیقات علمی و هم برای تشخیص در مراقبت های بهداشتی عملی و خدمات نظارت بهداشتی و اپیدمیولوژیک دولتی (ژنوتیپ، تشخیص بیماری های عفونی) استفاده می شود.

روش PCR مبتنی بر یک فرآیند طبیعی است - تکمیل مکمل الگوی DNA، که با کمک آنزیم DNA پلیمراز انجام می شود. این واکنش نامیده می شود همانندسازی DNA

همانندسازی طبیعی DNA شامل چندین مرحله است:

1) دناتوره شدن DNA(باز کردن مارپیچ دوگانه، واگرایی رشته های DNA)؛

2) تشکیل قطعات DNA دو رشته ای کوتاه(دانه های مورد نیاز برای شروع سنتز DNA)؛

3) سنتز یک رشته DNA جدید(تکمیل هر دو رشته)

از این فرآیند می توان برای به دست آوردن کپی استفاده کرد بخش های کوتاه DNA مخصوص میکروارگانیسم های خاص،آن ها برای انجام یک جستجوی هدفمند برای چنین مناطق خاصی، که هدف تشخیص ژن برای شناسایی پاتوژن های بیماری های عفونی است.

کشف DNA پلیمراز پایدار در برابر حرارت (Taq polymerase) از باکتری های گرمادوست ترمیس آبزیکه بهینه آن در منطقه 70-72 درجه سانتیگراد است، امکان چرخه ای کردن فرآیند همانندسازی DNA و استفاده از آن برای کار در شرایط آزمایشگاهی را فراهم می کند. ایجاد ترموستات های قابل برنامه ریزی (تقویت کننده ها)، که طبق یک برنامه مشخص، تغییرات دمای چرخه ای را انجام می دهند، پیش نیازها را برای معرفی گسترده روش PCR در عمل آزمایشگاهی ایجاد کرد. تشخیص بالینی. با تکرار مکرر چرخه‌های سنتز، افزایش تصاعدی در تعداد کپی‌های یک قطعه DNA خاص رخ می‌دهد که امکان به دست آوردن تعداد کافی کپی DNA از مقدار کمی از مواد تجزیه‌وتحلیل‌شده را ممکن می‌سازد، که ممکن است حاوی سلول‌های تکی از میکروارگانیسم‌ها باشد. ، برای شناسایی آنها با الکتروفورز.

تکمیل مکمل زنجیره در هیچ نقطه ای از توالی DNA آغاز نمی شود، بلکه فقط در بلوک های شروع خاصی - بخش های دو رشته ای کوتاه. با چسباندن چنین بلوک هایی به مناطق خاصی از DNA، می توان فرآیند سنتز یک رشته جدید را فقط در این ناحیه هدایت کرد و نه در طول کل رشته DNA. برای ایجاد بلوک های شروع در مناطق DNA داده شده، از دو آغازگر اولیگونوکلئوتیدی (20 جفت نوکلئوتیدی) استفاده می شود که به نام آغازگرهاپرایمرها مکمل توالی های DNA در مرزهای چپ و راست یک قطعه خاص هستند و به گونه ای جهت گیری شده اند که تکمیل یک رشته DNA جدید فقط بین آنها اتفاق می افتد.

بنابراین، PCR افزایش چند برابری در تعداد کپی ها (تقویت) یک ناحیه DNA خاص است که توسط آنزیم DNA پلیمراز کاتالیز می شود.

اجزای زیر برای تقویت مورد نیاز است:

مخلوطی از دئوکسی نوکلئوتید تری فسفات (dNTPs)(مخلوطی از چهار dNTP که ماده ای برای سنتز رشته های DNA مکمل جدید هستند)

آنزیم Taq پلیمراز(یک DNA پلیمراز مقاوم در برابر حرارت که با افزودن متوالی بازهای نوکلئوتیدی به زنجیره در حال رشد DNA سنتز شده، طولانی شدن زنجیره های آغازگر را کاتالیز می کند).

محلول بافر(محیط واکنش حاوی یونهای Mg2+ لازم برای حفظ فعالیت آنزیم)
برای تعیین نواحی خاصی از ژنوم ویروس های حاوی RNA، ابتدا یک کپی DNA از یک الگوی RNA با استفاده از واکنش رونویسی معکوس (RT) که توسط آنزیم ترانس کریپتاز معکوس (ترانس کریپتاز معکوس) کاتالیز می شود، به دست می آید.

برای به دست آوردن تعداد کافی کپی از قطعه مشخصه DNA مورد نظر، تقویت شامل چندین چرخه (20-40) است.

هر چرخه تقویت شامل 3 مرحله است که در شرایط دمایی مختلف انجام می شود

مرحله 1: دناتوره شدن DNA(باز شدن مارپیچ دوتایی). در دمای 93-95 درجه سانتیگراد به مدت 30-40 ثانیه جریان دارد.

مرحله 2: اتصال پرایمرها (پخت).چسباندن پرایمر مکمل توالی های مربوطه در رشته های DNA مخالف در مرزهای یک مکان خاص رخ می دهد. هر جفت پرایمر دمای بازپخت مخصوص به خود را دارد که مقادیر آن در محدوده 50-65 درجه سانتیگراد است. زمان بازپخت -20-60 ثانیه.

مرحله 3: ساخت زنجیره های DNA.تکمیل مکمل زنجیره های DNA از انتهای 5' تا انتهای 3' زنجیره در جهات مخالف و از محل های اتصال پرایمر شروع می شود. ماده برای سنتز زنجیره های DNA جدید، تری فسفات های دئوکسی ریبونوکلئوتید (dNTPs) هستند که به محلول اضافه می شوند. فرآیند سنتز توسط آنزیم DNA پلیمراز پایدار در برابر حرارت (Taq polymerase) کاتالیز می شود و در دمای 70-72 درجه سانتی گراد انجام می شود. زمان سنتز - 20-40 ثانیه.

رشته های DNA جدید تشکیل شده در اولین چرخه تقویت به عنوان الگو برای چرخه تقویت دوم، که در آن قطعه DNA خاص مورد نظر (آمپلیکون) تشکیل می شود، عمل می کند. (شکل 2 را ببینید). در چرخه های تقویت بعدی، آمپلیکون ها به عنوان الگویی برای سنتز زنجیره های جدید عمل می کنند. بنابراین، تجمع آمپلیکون ها در محلول طبق فرمول 2n اتفاق می افتد، که در آن n تعداد چرخه های تقویت است. بنابراین، حتی اگر در ابتدا تنها یک مولکول DNA دو رشته ای در محلول اولیه وجود داشته باشد، حدود 108 مولکول آمپلیکون پس از 30 تا 40 چرخه در محلول تجمع می یابد. این مقدار برای تشخیص بصری مطمئن این قطعه توسط الکتروفورز ژل آگارز کافی است. فرآیند تقویت در یک ترموستات ویژه قابل برنامه ریزی (تقویت کننده) انجام می شود که طبق برنامه مشخص شده، به طور خودکار دما را با توجه به تعداد چرخه های تقویت تغییر می دهد.

مراحل PCR - آنالیز

در قلب روش PCR به عنوان یک ابزار تشخیص آزمایشگاهیبیماری های عفونی در تشخیص یک قطعه DNA کوچک از پاتوژن (چند صد جفت باز)، که فقط برای این میکروارگانیسم اختصاص دارد، با استفاده از یک واکنش زنجیره ای پلیمراز برای تجمع قطعه مورد نظر است.
تکنیک تجزیه و تحلیل با استفاده از روش PCR شامل سه مرحله است:

1. جداسازی DNA (RNA) از نمونه بالینی

2. تکثیر قطعات خاص DNA
3. تشخیص محصولات تقویت

جداسازی DNA (RNA)
در این مرحله از تجزیه و تحلیل، نمونه بالینی تحت پردازش خاصی قرار می گیرد که منجر به لیز مواد سلولی، حذف بخش های پروتئین و پلی ساکارید و تهیه محلول DNA یا RNA عاری از
بازدارنده و آماده برای تقویت بیشتر.
انتخاب روش استخراج DNA (RNA) عمدتاً با ماهیت مواد بالینی پردازش شده تعیین می شود.

تکثیر قطعات خاص DNA
در این مرحله، قطعات اختصاصی DNA کوتاه به مقدار لازم برای تشخیص بیشتر آنها انباشته می شوند. اکثر روش‌ها برای تعیین قطعات خاص ژنوم از روش‌هایی استفاده می‌کنند. یک نسخه کلاسیک از PCR جهت دار. برای افزایش ویژگی و حساسیت تجزیه و تحلیل، برخی از روش ها از روش PCR "تودرتو" استفاده می کنند که از 2 جفت پرایمر ("خارجی" - برای مرحله 1 و "داخلی" - برای مرحله 2 استفاده می کند.

تشخیص محصولات تقویتی
در اکثر تکنیک ها، در این مرحله، مخلوط محصولات تقویتی به دست آمده در مرحله 2 توسط الکتروفورز ژل آگارز افقی جدا می شود. قبل از جداسازی الکتروفورتیک، محلول اتیدیوم بروماید به مخلوط تقویتی اضافه می شود که اتصالات بینابینی قوی با قطعات DNA دو رشته ای ایجاد می کند. این ترکیبات تحت اثر تابش اشعه ماوراء بنفش قادر به فلورسانس هستند که پس از جداسازی الکتروفورتیک مخلوط تقویتی در ژل آگارز به صورت نوارهای درخشان نارنجی قرمز ثبت می شود.

به عنوان جایگزینی برای روش تشخیص الکتروفورتیک، که دارای معایبی است: ذهنیت در خواندن نتایج، محدودیت در تعیین DNA میکروارگانیسم های مختلف در یک واکنش، می تواند پیشنهاد شود. طرح های تشخیص هیبریداسیوندر این طرح ها، قطعه DNA حاصل از تقویت با یک پروب الیگونوکلئوتیدی خاص هیبرید می شود (کپلکس های 2 رشته ای - "هیبریدها" را تشکیل می دهد. ثبت چنین مجتمع هایی می تواند به صورت رنگ سنجی یا فلورمتری انجام شود. SPC "Litekh" کیت های تشخیص را بر اساس هیبریداسیون با ثبت نتایج فلورمتری ایجاد کرد.

مزایای روش PCR به عنوان روشی برای تشخیص بیماری های عفونی:

- تشخیص مستقیم وجود عوامل بیماری زا

زیاد روش های سنتیتشخیص، مانند ایمونواسی آنزیمی، پروتئین های نشانگر را نشان می دهد که محصولات فعالیت حیاتی عوامل عفونی هستند، که تنها شواهد غیرمستقیم از وجود عفونت را ارائه می دهد. شناسایی ناحیه DNA خاصی از پاتوژن توسط PCR نشانه مستقیمی از وجود عامل عفونی می دهد.

- ویژگی بالا
ویژگی بالای روش PCR به این دلیل است که یک قطعه DNA منحصر به فرد، مشخصه فقط برای این پاتوژن، در ماده آزمایش تشخیص داده می شود. ویژگی توسط توالی نوکلئوتیدی پرایمرها تعیین می شود، که حذف می کند
امکان به دست آوردن نتایج نادرست، بر خلاف روش ایمونواسی آنزیمی، که در آن خطاها به دلیل واکنش متقابل آنتی ژن ها غیر معمول نیستند.

- حساسیت بالا
روش PCR به شما امکان می دهد حتی سلول های تک باکتری یا ویروس را شناسایی کنید. تشخیص PCR وجود پاتوژن های بیماری های عفونی را در مواردی که روش های دیگر (ایمونولوژیک، باکتریولوژیک،
میکروسکوپی) غیر ممکن است. حساسیت آنالیز PCR 1000-10 سلول در هر نمونه است (حساسیت تست های ایمونولوژیک و میکروسکوپی 105-103 سلول است).

- جهانی بودن روش برای شناسایی پاتوژن های مختلف
ماده مورد مطالعه توسط PCR DNA پاتوژن است. این روش مبتنی بر تشخیص یک قطعه DNA یا RNA است که مختص یک ارگانیسم خاص است. شباهت ترکیب شیمیایی تمام اسیدهای نوکلئیک امکان استفاده از روش های یکپارچه برای هدایت را فراهم می کند تحقیقات آزمایشگاهی. این امر تشخیص چندین پاتوژن را از یک سنجش زیستی ممکن می سازد. از ترشحات بیولوژیکی مختلف (مخاط، ادرار، خلط)، خراش دادن سلول های اپیتلیال، خون، سرم می توان به عنوان ماده آزمایش استفاده کرد.

- سرعت بالا در به دست آوردن نتیجه تجزیه و تحلیل
تجزیه و تحلیل PCR نیازی به جداسازی و کشت پاتوژن ندارد تعداد زیادی اززمان. یک روش یکپارچه برای پردازش مواد زیستی و تشخیص محصولات واکنش، و اتوماسیون فرآیند تقویت، انجام تجزیه و تحلیل کامل را در 4-4.5 ساعت ممکن می سازد.

لازم به ذکر است که روش PCR می تواند عوامل بیماری زا را نه تنها در مواد بالینی به دست آمده از بیمار، بلکه در مواد به دست آمده از اشیاء محیطی (آب، خاک و ...) شناسایی کند.

کاربرد روش PCR در مراقبت های بهداشتی عملی

استفاده از روش PCR برای تشخیص بیماری های عفونی با ماهیت باکتریایی و ویروسی برای حل بسیاری از مشکلات میکروبیولوژی و اپیدمیولوژی از اهمیت بالایی برخوردار است. استفاده از این روش همچنین به توسعه تحقیقات بنیادی در زمینه بیماری های عفونی مزمن و کمتر مطالعه شده کمک می کند.

موثرترین و توجیه اقتصادی ترین استفاده از روش در موارد زیر است:

عمل اوروژنیکولوژیک- برای تشخیص کلامیدیا، اوره پلاسموز، سوزاک، تبخال، گاردنرلوز، عفونت مایکوپلاسما.

در ریه- برای تشخیص های افتراقیپنومونی ویروسی و باکتریایی، سل؛

در گوارش- برای تشخیص هلیکوباکتریوز؛

در کلینیک بیماری های عفونی- به عنوان یک روش اکسپرس برای تشخیص سالمونلوز، دیفتری، ویروسی هپاتیت B، Cو G;

در هماتولوژی- برای تشخیص عفونت سیتومگالوویروس، انکوویروس ها.

1. واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)

2. اصل روش واکنش زنجیره ای پلیمراز

2.1 وجود تعدادی از اجزاء در مخلوط واکنش

2.2 چرخه دما

2.3 اصول اولیه انتخاب پرایمر

2.4 اثر فلات

3. مراحل تنظیم PCR

3.2 تقویت

3.4.1 کنترل های مثبت

3.4.2 کنترل های داخلی

4.1 تجزیه و تحلیل کیفی

4.1.2 تشخیص مولکول های RNA

3.1 تهیه نمونه از مواد بیولوژیکی

یکی از روش های رایج در حال حاضر، روش استخراج DNA است که توسط بوم و همکاران پیشنهاد شده است. این روش مبتنی بر استفاده از یک عامل آشوب‌گردان قوی، گوانیدین تیوسیانات (GuSCN) برای لیز سلولی و جذب DNA بعدی بر روی یک حامل (دانه‌های شیشه‌ای، خاک دیاتومه، شیر شیشه‌ای و غیره) است. پس از شستشو، DNA در نمونه جذب شده بر روی حامل باقی می ماند، که می توان آن را به راحتی با استفاده از یک بافر شستشو از آن جدا کرد. این روش راحت، از نظر فناوری پیشرفته و مناسب برای آماده سازی نمونه برای تقویت است. با این حال، از دست دادن DNA به دلیل جذب غیرقابل برگشت در حامل و همچنین در طول شستشوهای متعدد امکان پذیر است. این امر به ویژه هنگام کار با مقادیر کمی DNA در نمونه بسیار مهم است. علاوه بر این، حتی مقادیر کمی از GuSCN می تواند PCR را مهار کند. بنابراین، هنگام استفاده از این روش، انتخاب صحیح جاذب و رعایت دقیق نکات ظریف تکنولوژیکی بسیار مهم است.

بنابراین، انتخاب روش آماده‌سازی نمونه باید با درک اهداف تحلیل‌های مورد نظر مورد بررسی قرار گیرد.

3.2 تقویت

3.3 ارزیابی نتایج واکنش

3.3.1 روش الکتروفورز افقی

روش های مختلفی برای تجسم نتایج تقویت استفاده می شود. رایج ترین روش امروزه روش الکتروفورز است که بر اساس جداسازی مولکول های DNA بر اساس اندازه است. برای انجام این کار، یک صفحه ژل آگارز تهیه می شود که آگارز پس از ذوب در بافر الکتروفورز با غلظت 1.5-2.5٪ با افزودن یک رنگ خاص DNA، به عنوان مثال، اتیدیوم بروماید، منجمد می شود. آگارز منجمد یک شبکه فضایی را تشکیل می دهد. هنگام ریختن با کمک شانه، چاه های خاصی در ژل ایجاد می شود که متعاقباً محصولات تقویت کننده به آنها اضافه می شود. صفحه ژل برای الکتروفورز ژل افقی در دستگاه قرار می گیرد و منبع متصل می شود ولتاژ ثابت. DNA با بار منفی شروع به حرکت در ژل از منفی به مثبت می کند. در عین حال، مولکول‌های DNA کوتاه‌تر سریع‌تر از مولکول‌های بلند حرکت می‌کنند. سرعت حرکت DNA در ژل تحت تأثیر غلظت آگارز، قدرت میدان الکتریکی، دما، ترکیب بافر الکتروفورز و تا حدودی ترکیب GC DNA است. همه مولکول های یک اندازه با سرعت یکسان حرکت می کنند. رنگ در گروه های مسطح در مولکول های DNA جاسازی می شود. پس از اتمام الکتروفورز که از 10 دقیقه تا 1 ساعت به طول می انجامد، ژل بر روی فیلتر یک ترانس تابش نور در محدوده فرابنفش (254 - 310 نانومتر) قرار می گیرد. انرژی UV جذب شده توسط DNA در 260 نانومتر به رنگ منتقل می شود و باعث فلورسانس آن در ناحیه نارنجی مایل به قرمز طیف مرئی (590 نانومتر) می شود.

روشنایی باندهای محصولات تقویت کننده می تواند متفاوت باشد. با این حال، این نمی تواند به مقدار اولیه DNA هدف در نمونه مربوط باشد.

3.3.2 روش الکتروفورز عمودی

روش الکتروفورز عمودی اساساً مشابه الکتروفورز افقی است. تفاوت آنها در این است که در این مورد به جای آگارز از ژل های پلی آکریل آمید استفاده می شود. این در یک محفظه مخصوص برای الکتروفورز عمودی انجام می شود. الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید وضوح بالاتری نسبت به الکتروفورز آگارز دارد و تشخیص مولکول های DNA در اندازه های مختلف را با دقت یک نوکلئوتید ممکن می سازد. تهیه ژل پلی آکریل آمید تا حدودی پیچیده تر از آگارز است. علاوه بر این، آکریل آمید یک ماده سمی است. از آنجایی که نیاز به تعیین اندازه محصول تقویتی با دقت 1 نوکلئوتید به ندرت ایجاد می شود، روش الکتروفورز افقی در کارهای معمول استفاده می شود.

3.4 نظارت بر پیشرفت واکنش تقویت

3.4.1 کنترل های مثبت

به عنوان یک "کنترل مثبت" از آماده سازی DNA میکروارگانیسم مورد نظر استفاده کنید. آمپلیکون های غیر اختصاصی از نظر اندازه با آمپلیکن های تولید شده توسط تقویت با آماده سازی DNA کنترل متفاوت است. اندازه محصولات غیر اختصاصی می تواند بزرگتر یا کوچکتر از کنترل مثبت باشد. در بدترین حالت، این ابعاد ممکن است منطبق باشند و در الکتروفورز مثبت خوانده شوند.

برای کنترل ویژگی محصول تقویت شده، می توان از پروب های هیبریداسیون (مناطق DNA واقع در توالی قابل تقویت) که با برچسب های آنزیمی یا ایزوتوپ های رادیواکتیو برچسب گذاری شده اند و مطابق با اصول اولیه پرایمرها با DNA برهم کنش دارند، استفاده کرد. این امر تجزیه و تحلیل را بسیار پیچیده و طولانی می کند و هزینه آن به میزان قابل توجهی افزایش می یابد.

3.4.2 کنترل های داخلی

کنترل پیشرفت تقویت در هر لوله با مخلوط واکنش ضروری است. برای این منظور، از یک کنترل اضافی به نام "کنترل داخلی" استفاده می شود. هر گونه آماده سازی DNA است که مشابه DNA میکروارگانیسم مورد نظر نباشد. اگر کنترل داخلی به مخلوط واکنش وارد شود، همان هدف برای بازپخت پرایمر مانند DNA کروموزومی عامل عفونی مورد نظر خواهد بود. اندازه محصول تقویت کننده کنترل داخلی به گونه ای انتخاب می شود که 2 یا بیشتر از آمپلیکون های تولید شده از تقویت DNA هدف میکروارگانیسم بزرگتر باشد. در نتیجه، اگر DNA کنترل داخلی همراه با نمونه آزمایش به مخلوط واکنش وارد شود، بدون در نظر گرفتن وجود یک میکروارگانیسم در نمونه بیولوژیکی، کنترل داخلی باعث تشکیل آمپلیکون های خاص، اما بسیار طولانی تر (سنگین تر) می شود. از آمپلیکون میکروارگانیسم. وجود آمپلیکون های سنگین در مخلوط واکنش نشان دهنده سیر طبیعی واکنش تقویت و عدم وجود بازدارنده خواهد بود. در صورتی که آمپلیکون های اندازه مورد نیاز تشکیل نشده باشند، اما آمپلیکن های کنترل داخلی نیز تشکیل نشده باشند، می توان نتیجه گرفت که نمونه آنالیز شده حاوی ناخالصی های نامطلوب است که باید حذف شوند، اما عدم وجود DNA مورد نظر.

متأسفانه با وجود همه جذابیت‌های این رویکرد، یک نقص قابل توجه دارد. اگر DNA مورد نیاز در مخلوط واکنش وجود داشته باشد، به دلیل رقابت با کنترل داخلی برای آغازگرها، راندمان تقویت آن به شدت کاهش می یابد. این امر به ویژه در غلظت های پایین DNA در نمونه آزمایش مهم است که می تواند منجر به نتایج منفی کاذب شود.

با این وجود، به شرطی که مشکل رقابت برای پرایمرها حل شود، این روش کنترل راندمان تقویت قطعا بسیار مفید خواهد بود.

4. روش های مبتنی بر واکنش زنجیره ای پلیمراز

4.1 تجزیه و تحلیل کیفی

روش کلاسیک راه اندازی PCR، که اصول آن در بالا ذکر شد، در برخی اصلاحات با هدف غلبه بر محدودیت های PCR و افزایش کارایی واکنش ایجاد شده است.

4.1.1 نحوه تنظیم PCR با استفاده از "شروع داغ"

برای کاهش خطر تشکیل محصولات غیراختصاصی واکنش تقویتی، از رویکردی به نام «شروع داغ» استفاده می‌شود که ماهیت آن جلوگیری از امکان شروع واکنش است تا زمانی که شرایطی در لوله ایجاد شود که بازپخت اختصاصی لوله را تضمین کند. آغازگرها

واقعیت این است که بسته به ترکیب و اندازه HC، آغازگرها دمای ذوب مشخصی (Tm) دارند. اگر دمای سیستم از Tm بیشتر شود، پرایمر نمی تواند به رشته DNA بچسبد و دناتوره شود. تحت شرایط بهینه، یعنی دمای بازپخت نزدیک به دمای ذوب، پرایمر تنها در صورتی یک مولکول دو رشته‌ای را تشکیل می‌دهد که کاملاً مکمل هم باشد و بنابراین ویژگی واکنش را تضمین می‌کند.

گزینه های مختلفی برای اجرای "شروع داغ" وجود دارد:

معرفی Taq پلیمراز به مخلوط واکنش در اولین چرخه پس از گرم کردن لوله تا دمای دناتوراسیون.

جداسازی اجزای مخلوط واکنش توسط یک لایه پارافین به لایه ها (پرایمرها در قسمت پایین، Taq پلیمراز و DNA هدف در قسمت بالایی) که هنگام ذوب پارافین (~65-75 0 C) مخلوط می شوند.

استفاده از آنتی بادی های مونوکلونال برای Taq پلیمراز. آنزیم محدود شده توسط آنتی بادی های مونوکلونال تنها پس از اولین مرحله دناتوراسیون فعال می شود، زمانی که آنتی بادی های مونوکلونال به طور غیر قابل برگشتی دناتوره می شوند و محل های فعال Taq پلیمراز را آزاد می کنند.

در همه این موارد، حتی اگر بازپخت غیراختصاصی قبل از شروع چرخه حرارتی رخ داده باشد، ازدیاد طول رخ نمی‌دهد و کمپلکس‌های پرایمر-DNA با گرم شدن دناتوره می‌شوند، بنابراین هیچ محصول غیر اختصاصی تشکیل نمی‌شود. پس از آن، درجه حرارت در لوله از نقطه ذوب پایین نمی آید، که تشکیل یک محصول تقویتی خاص را تضمین می کند.

4.1.2 تشخیص مولکول های RNA

امکان استفاده از RNA به عنوان هدف برای PCR به طور قابل توجهی دامنه کاربردهای این روش را گسترش می دهد. به عنوان مثال، ژنوم بسیاری از ویروس ها (هپاتیت C، ویروس آنفولانزا، پیکورناویروس و غیره) با RNA نشان داده می شود. در عین حال، هیچ مرحله میانی از تبدیل به DNA در چرخه زندگی آنها وجود ندارد. برای تشخیص RNA، ابتدا باید به شکل DNA تبدیل شود. برای این کار از ترانس کریپتاز معکوس استفاده می شود که از دو جدا شده است ویروس های مختلف: ویروس میلوبلاستوز پرندگان و ویروس لوسمی موش مولونی. استفاده از این آنزیم ها با مشکلاتی همراه است. اول از همه، آنها حرارت پذیر هستند و بنابراین می توانند در دمای بیش از 42 درجه سانتیگراد استفاده شوند. از آنجایی که در این دما مولکول های RNA به راحتی ساختارهای ثانویه تشکیل می دهند، راندمان واکنش به طور قابل توجهی کاهش می یابد و طبق برآوردهای مختلف، تقریباً 5٪ است. تلاش‌هایی برای دور زدن این ضرر با استفاده از یک پلیمراز مقاوم در برابر حرارت به‌دست‌آمده از میکروارگانیسم گرمادوست Thermus Thermophilus، که فعالیت ترانس کریپتاز را در حضور Mn 2+ نشان می‌دهد، به عنوان یک رونوشت معکوس انجام می‌شود. این تنها آنزیم شناخته شده ای است که قادر به نشان دادن فعالیت پلیمراز و ترانس کریپتاز است.

برای انجام واکنش رونویسی معکوس، مخلوط واکنش، و همچنین در PCR، باید حاوی پرایمرهایی به عنوان دانه و مخلوطی از 4 dNTP به عنوان مصالح ساختمانی باشد.

پس از واکنش رونویسی معکوس، مولکول های cDNA حاصل می توانند به عنوان یک هدف برای PCR عمل کنند.

5. سازماندهی فرآیند تکنولوژیکی تنظیم PCR

حساسیت بالقوه بالای واکنش زنجیره ای پلیمراز، طراحی دقیق آزمایشگاه PCR را کاملا ضروری می کند. این به دلیل حادترین مشکل روش - آلودگی است.

آلودگی - ورود از محیط خارجی به مخلوط واکنش مولکول های DNA خاص که می تواند به عنوان هدف در واکنش تقویت عمل کند و نتایج مثبت کاذب بدهد.

راه های مختلفی برای مقابله با این پدیده ناخوشایند وجود دارد. یکی از آنها استفاده از آنزیم N-uracil glycosylase (UG) است. این روش مبتنی بر توانایی UG برای بریدن مولکول های DNA با اوراسیل جاسازی شده است. واکنش تقویت با استفاده از مخلوط dNTP انجام می شود که در آن dTTP با اوراسیل جایگزین می شود و پس از چرخه حرارتی، تمام آمپلیکون های تشکیل شده در لوله حاوی اوراسیل خواهند بود. اگر HC قبل از تقویت به مخلوط واکنش اضافه شود، آمپلیکون هایی که وارد مخلوط واکنش می شوند از بین می روند، در حالی که DNA بومی دست نخورده باقی می ماند و متعاقبا به عنوان هدف برای تقویت عمل می کند.

بنابراین، این روش تنها تا حدی منبع آلودگی را از بین می برد و در برابر نتایج مثبت کاذب تضمین نمی کند.

روش دیگر برای مقابله با نتایج آلودگی، کاهش قابل توجه تعداد چرخه های واکنش (تا 25-30 چرخه) است. اما حتی با این رویکرد، خطر به دست آوردن نتایج مثبت کاذب زیاد است، زیرا در این حالت، در صورت عدم وجود بازدارنده، به راحتی می توان محصول تقویت کننده را به دلیل آلودگی به دست آورد.

بنابراین، علی‌رغم مزایای اقدامات پیش از تقویت با هدف غیرفعال کردن مولکول‌های DNA که باعث نتایج مثبت کاذب می‌شوند، رادیکال‌ترین راه‌حل، سازماندهی دقیق آزمایشگاه است.

نتیجه

روش PCR در حال حاضر بیشترین کاربرد را به عنوان روشی برای تشخیص انواع بیماری های عفونی دارد. PCR به شما امکان می دهد تا علت عفونت را شناسایی کنید، حتی اگر نمونه گرفته شده برای تجزیه و تحلیل فقط حاوی چند مولکول DNA از پاتوژن باشد. PCR به طور گسترده در تشخیص زودهنگام عفونت HIV، هپاتیت ویروسی و غیره استفاده می شود. تا به امروز، تقریبا هیچ عامل عفونی وجود ندارد که با استفاده از PCR قابل تشخیص نباشد.