頭の腫れ

PCR技術。 PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）。 PCR診断の実施方法、適応症、研究の準備方法、PCRの結果。 PCR分析-それは何ですか

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）-分子生物学における生化学的技術の方法であり、DNAフラグメントの1つまたは複数のコピーを数度増やすことを目的として実行されます。これにより、特定のDNA配列の数千から数百万のコピーを作成できます。

1983年にCaryMullisによって開発されたPCR法は、現在、多くの異なるアプリケーションの医学および生物学研究所で使用される一般的で、しばしば不可欠な方法です。これらには、シーケンシングのためのDNAクローニング、DNAベースの系統発生、または遺伝子の機能分析が含まれます。遺伝性疾患の診断; 遺伝子指紋の識別（法医学の分野および親子鑑定で使用される）、ならびに感染症の検出および診断。 1993年、Mullisは、PCRの研究で、MichaelSmithとともにノーベル化学賞を受賞しました。

この方法は、酵素によってDNAを変性および複製するための加熱および冷却反応の繰り返しサイクルからなる熱サイクリングに基づいています。 DNAポリメラーゼ（メソッドの名前の由来）とともに標的部位に相補的な配列を含むプライマー（DNAの短い断片）は、選択的および再増幅を促進するための重要なコンポーネントです。 PCRプロセスでは、合成されたDNA自体が複製のテンプレートとして使用され、テンプレートDNAが指数関数的に増幅される連鎖反応が開始されます。 PCRは、広範囲の遺伝子操作を実行するように大幅に変更できます。

ほとんどすべてのPCRアプリケーションは、バクテリアから最初に分離された酵素であるTaqポリメラーゼなどの熱安定性DNAポリメラーゼを使用します。 サーマス水生生物。このDNAポリメラーゼは、一本鎖DNAをテンプレートとして使用し、DNA合成を開始するために必要なDNAオリゴヌクレオチド（DNAプライマーとも呼ばれる）を使用して、DNAの構成要素であるヌクレオチドから新しいDNA鎖を酵素的に組み立てます。 PCR法の大部分は、サーマルサイクリングを使用します。つまり、特定の一連の温度ステップでPCRサンプルを交互に加熱および冷却します。これらの熱サイクリングステップは、DNA変性と呼ばれるプロセスで、高温でDNA二重らせんの2本の鎖を物理的に分離するために最初に必要です。より低い温度では、各鎖は、標的DNA領域を選択的に増幅するために、DNAポリメラーゼによるDNA合成のテンプレートとして使用されます。特定のサーマルサイクリング条件下で増幅するためのターゲットDNA領域に相補的なプライマーを使用したPCR結果の選択性。

PCR診断の原則

PCRは、DNA鎖の特定のセクション（ターゲットDNA）を増幅するために使用されます。ほとんどのPCR法は、通常、最大10,000塩基対（kb）のDNAフラグメントを増幅しますが、一部の方法では、フラグメントを最大40kbのサイズにスケールアップできます。反応は、限られた量の最終増幅産物を生成します。これは、反応で利用可能な試薬と反応生成物のフィードバック阻害によって制御されます。

基本的なPCRキットには、いくつかのコンポーネントと試薬が必要です。これらには以下が含まれます：

DNAテンプレート、増幅されるターゲットDNA領域が含まれています。
2つのプライマー、標的DNAのセンス鎖とアンチセンス鎖のそれぞれの3 '末端に相補的です。
Taqポリメラーゼまたは約70°Cの最適温度で動作する別のDNAポリメラーゼ。
デオキシヌクレオシド三リン酸（dNTP;ヌクレオチドを含む三リン酸基）、DNAポリメラーゼが新しいDNA鎖を合成するための構成要素。
緩衝液、DNAポリメラーゼの最適な活性と安定性のための適切な化学的条件を提供します。
二価カチオン、マグネシウムまたはマンガンイオン; Mg2 +が一般的に使用されますが、Mn2 +の濃度が高いとDNA合成中のエラー率が高くなるため、Mn2 +はPCRを介したDNA変異誘発にも使用できます。
一価カチオンカリウムイオン。

PCRは通常、サーマルサイクラーアンプの小さな反応チューブ（容量0.2〜0.5 ml）で10〜200 µlの反応容量で実行されます。サイクラーは反応管を加熱および冷却して、反応の各ステップに必要な温度を達成します。最近の多くのサイクラーは、電流の方向を逆にするだけでPCRチューブアセンブリの加熱と冷却を可能にするペルティエ効果を使用しています。薄壁の反応チューブは、良好な熱伝導率を促進して、迅速な熱平衡を確保します。加熱された蓋がない古いサイクラーは、反応混合物の表面に油の層またはバイアル内のワックスのビーズを必要とします。

手順の順序

通常、PCRはサイクルと呼ばれる一連の20〜40回の繰り返し温度変化で構成され、各サイクルは通常2〜3回の個別の温度ステップ（通常は3回）で構成されます。サイクリングは、多くの場合、単一の温度ステップで開始および終了します（いわゆる期待）製品の最終膨張または短期間の保管のために高温（> 90°C）で。使用される温度と各サイクルでのそれらの適用の期間は、多くのパラメータに依存します。これらには、DNA合成に使用される酵素、反応中の2価イオンとdNTPの濃度、およびプライマーの融点（Tm）が含まれます。

初期化段階：このステップは、反応を94〜96°C（または熱安定性の高いポリメラーゼを使用する場合は98°C）の温度に加熱することで構成され、1〜9分間実行されます。このステップは、熱活性化を必要とするDNAポリメラーゼ、いわゆるホットスタートPCRにのみ必要です。
変性ステップ：これは最初の定期的なサーマルサイクリングイベントであり、反応を94〜98°Cに20〜30秒間加熱することで構成されます。これにより、相補的な塩基間の水素結合が破壊され、一本鎖DNA分子が形成されてDNAテンプレートが切断されます。
アニーリングステップ：反応温度を50〜65℃に20〜40秒間下げます。これにより、プライマーが一本鎖DNAテンプレートに結合できるようになります。通常、アニーリング温度は、使用するプライマーのTmより約3〜5℃低くなります。安定したDNA-DNA水素結合は、プライマー配列が配列テンプレートとより厳密に一致する場合にのみ形成されます。ポリメラーゼはプライマー-テンプレートハイブリッドに結合し、DNA合成を開始します。
膨張/伸長段階：このステップ中の温度は、使用するDNAポリメラーゼによって異なります。 Taqポリメラーゼの最適な活性温度は75〜80℃です。この酵素には72℃の温度が一般的に使用されます。この段階で、DNAポリメラーゼは、5 "から3"の方向にテンプレートに相補的なdNTPを追加し、dNTPの5 "-リン酸基を3"-に結合することにより、DNAテンプレート鎖に相補的な新しいDNA鎖を合成します。得られた（拡張する）DNAの末端にあるヒドロキシル基。伸長時間は、使用するDNAポリメラーゼと増幅するDNA断片の長さの両方に依存します。通常、最適な温度で、DNAポリメラーゼは1分あたり1000塩基を重合します。最適な条件下で、すなわち基質または試薬の制限による制限がない場合、各拡張ステップで、ターゲットDNAの量が2倍になり、DNAフラグメントの指数関数的（幾何学的）増幅が生じます。
最終的な拡張：これが唯一のステップであり、最後のPCRサイクル後70〜74°Cで5〜15分間実行され、残っている一本鎖DNAが完全に伸長していることを確認します。
最終的な期待： 4〜15°Cでのこのステップは、反応を短く保つために無期限に使用できます。 PCRが予想されるDNAフラグメント（「アンプリマー」または「アンプリコン」とも呼ばれる）を合成したかどうかを確認するために、アガロースゲル電気泳動を使用してPCR産物をサイズで分離します。 PCR産物のサイズは、既知のサイズのDNAフラグメントを含むDNAラダー（分子量マーカー）との比較によって決定され、PCR産物と一緒にゲル上で実行されます。

ポリメラーゼ連鎖反応の段階

PCRプロセスは、次の3つのステップに分けることができます。

指数関数的増幅：各サイクルで、生成物の量は2倍になります（100％の反応効率を想定）。反応は非常に敏感です：少量のDNAだけが必要です。
レベリングステージ：DNAポリメラーゼが活性を失い、dNTPやプライマーなどの試薬を消費すると反応が遅くなり、制限されます。 .
高原：試薬や酵素の枯渇により製品が蓄積しなくなりました。

PCRの最適化

実際には、PCRは成功しない可能性があります様々な理由特に、DNA副産物の増幅を引き起こす汚染に対する感受性のためです。これに関して、PCR条件を最適化するために多くの技術と手順が開発されてきました。外来DNA汚染は、潜在的なDNA汚染物質のプレPCR混合物を精製する実験室のプロトコルと手順によって処理されます。これには通常、PCRキットをPCR産物の分析または精製領域から分離し、使い捨てのプラスチック器具を使用し、反応ステップ間で作業面を完全に洗浄することが含まれます。プライマー設計技術は、PCR産物の分離を改善し、副産物の形成を回避する上で重要な役割を果たします。代替のバッファー成分またはポリメラーゼ酵素を使用すると、長いDNA領域や問題のあるDNA領域を増幅するのに役立ちます。バッファーシステムにホルムアミドなどの試薬を添加すると、PCRの特異性と回収率を高めることができます。理論的なPCR結果のコンピューターシミュレーション（電子PCR）を実行して、プライマーの設計を支援することができます。

PCRの応用

選択的DNA分離

PCRは、特定のDNA領域を選択的に増幅することにより、ゲノムDNAからDNAフラグメントを分離することを可能にします。このPCRのアプリケーションは、サザンブロッティングまたはノーザンブロッティング用のハイブリダイゼーションプローブの作成や、DNAの特定の領域を表す大量のDNAを必要とするDNAクローニング技術など、多くの技術を補完します。 PCRは、これらのメソッドに高含有量の純粋なDNAを提供します。これにより、少量の出発物質でもDNAサンプルの分析が可能になります。

PCRの他のアプリケーションには、未知のPCR増幅配列を特定するためのDNAシーケンシングが含まれ、増幅プライマーの1つをサンガーシーケンシングで使用できます。DNAシーケンシングは、プラスミドまたは遺伝物質へのDNA配列の挿入を含む組換えDNA技術を加速します。別の生物の。バクテリア（大腸菌）のコロニーは、ベクターDNAデザインを修正するためにPCRによって迅速にスクリーニングすることができます。 PCRは遺伝子フィンガープリントにも使用できます。さまざまなPCR法を使用して実験DNAを比較することにより、人または生物を識別する法医学で使用される手法。

一部の「指紋」PCR法は、識別力が高く、親子鑑定などの個人間の遺伝的関係を判断するために使用でき、親子鑑定に使用されます。この手法は、生物間の進化的関係を決定するためにも適用できます。

増幅と定量化 DNA

PCRはターゲットDNA領域のコピー数を増やすため、PCRを使用して非常に少量のサンプルを分析できます。これは、証拠として微量のDNAしか入手できない法医学的調査にとってしばしば重要です。 PCRは、数万年前の古代DNAの分析にも使用できます。これらのPCR法は、エジプトのミイラの分析からロシアの皇帝の識別に至るまでのアプリケーションで、40,000歳のマンモスなどの動物やヒトDNAで成功裏に使用されています。

定量的PCR法は、サンプルに存在する特定の配列の量を推定します。これは、遺伝子発現のレベルを定量化するためによく使用される方法です。リアルタイムPCRは、PCR増幅の各サイクル後に生成物DNAの蓄積を測定する確立されたDNA定量化ツールです。

病気の診断におけるPCR

PCRは、白血病やリンパ腫などの悪性疾患の早期診断を可能にします。これらは現在、癌研究で高度に開発されており、すでに日常的に使用されています。 PCRは、ゲノムDNAサンプルに対して直接実行して、他の方法よりも少なくとも10,000倍高い感度で転座特異的悪性細胞を検出できます。

PCRを使用すると、組織培養や動物モデルから、マイコバクテリア、嫌気性細菌、ウイルスなどの培養不能または成長の遅い生物を検出することもできます。微生物学の分野におけるPCR診断アプリケーションの基礎は、感染性病原体の同定と、特定の遺伝子による非病原性株と病原性株の区別です。

ウイルスDNAはPCRでも検出できます。プライマーはウイルスの標的DNA配列に特異的でなければならず、PCRは診断DNA検査またはウイルスゲノムの配列決定に使用できます。 PCRの感度が高いため、感染直後から発症前までウイルスを検出することができます。ウイルスのこの早期発見は、医師に重要な治療の選択肢を与える可能性があります。患者のウイルス量（「ウイルス量」）も測定できます定量的方法 PCRに基づくDNA分析。

基本的なポリメラーゼ連鎖反応法のバリエーション

対立遺伝子特異的PCR：一塩基多型（SNP）に基づく診断またはクローニング方法（DNAの一塩基の違い）。対立遺伝子間の違いを含むDNA配列の事前知識が必要であり、3 '末端がSNPにまたがるプライマーを使用します。テンプレートとプライマーの間にミスマッチがある場合、ストリンジェントなPCR増幅ははるかに効率が悪いため、SNP特異的での増幅は成功します。プライマーは、配列内の特定のSNPの存在についてシグナルを送ります。
PCRアセンブリまたはポリメラーゼサイクリングアセンブリ（PCP）：短い重複セグメントを持つ長いオリゴヌクレオチドのプールでのPCRによる長いDNA配列の人工合成。オリゴヌクレオチドはセンス鎖とアンチセンス鎖の方向を交互に切り替え、重複するセグメントがPCRフラグメントの順序を決定し、それによって最終的な長いDNA産物を選択的に生成します。
非対称PCR：二本鎖DNAテンプレートの1本のDNAを優先的に増幅します。 2つの相補鎖のうちの1つだけの増幅が必要なシーケンシングおよびハイブリダイゼーションプロービングで使用されます。 PCRは通常どおり実行されますが、増幅を目的とした鎖のプライマーが大過剰になります。制限プライマーを使用した後の反応終了時の増幅が遅い（等差数列）ため、追加のPCRサイクルが必要です。「LATE-PCR」（指数期後の直線性-PCR）として知られるこのプロセスの最新の変更では、制限プライマーの濃度が低下するため、過剰なプライマーよりも融点（Tm）が高い制限プライマーを使用して反応効率を維持します。反応の途中で。
ダイヤルアウトPCR：遺伝子合成のための正確なDNA分子を取得するための高度に並列化された方法。 DNA分子の複雑なプールは、独自のフランクタグによって超並列シーケンスに変更されます。次に、タグ指向プライマーは、PCRによって配列決定された分子を提供します。
ヘリカーゼ依存性増幅：従来のPCRと同様ですが、変性およびアニーリング/拡張サイクルを繰り返すよりも一定の温度が必要です。熱変性の代わりに、DNAをほどく酵素であるDNAヘリカーゼを使用しています。
ホットスタートPCR：PCRステップの初期設定中に非特異的増幅を減らす技術。ポリメラーゼを添加する前に、反応成分を変性温度（例：95°C）に加熱することにより、手動で行うことができます。抗体結合によって、または高温活性化ステップの後にのみ解離する共有結合阻害剤の存在下で、室温でポリメラーゼ活性を阻害する特殊な酵素システムが開発されました。ホットスタート/コールドフィニッシュPCRは、周囲温度で不活性で、伸長温度で瞬時に活性化される新規ハイブリッドポリメラーゼを使用して実現されます。
マイクロサテライト配列特異的PCR（ISSR）：増幅されたフラグメント長から固有のフィンガープリントを取得するために、単純な反復配列間の領域のコピー数を増やすPCRDNAフィンガープリント法。
反転 PCRゲノムインサート周辺の配列領域を定義するために広く使用されています。これには一連のDNA切断と自己ライゲーションが含まれ、未知の配列の両端に既知の配列が生じます。
ライゲーションによって媒介されるPCR：目的のDNAにリンクされた小さなDNAリンカーと、DNAリンカーにリンクされたいくつかのプライマーを使用します。 DNAシーケンス、ゲノムウォーキング、およびDNAフットプリントに使用されます。
メチル化特異的PCR（MSP）：ジョンズホプキンス医科大学のStephenBailinとJimHermanによって開発され、ゲノムDNAのCpGアイランドのメチル化を検出するために使用されます。 DNAは最初に亜硫酸水素ナトリウムで処理されます。亜硫酸水素ナトリウムはメチル化されていないシトシン塩基をウラシルに変換します。ウラシルはPCRプライマーによってチミンとして認識されます。次に、プライマー配列内のCpGアイランドを除いて、同一のプライマーのセットを使用して、修飾されたDNAに対して2つのPCRが実行されます。これらの時点で、1セットのプライマーはシトシンでDNAを認識してメチル化DNAのコピー数を増やし、1セットはウラシルまたはチミンでDNAを認識して非メチル化DNAを増幅します。 qPCRを使用したMSPを実行して、メチル化に関する定性的情報ではなく定量的情報を取得することもできます。
ミニプライマー-PCR：熱安定性ポリメラーゼ（S-Tbr）が使用されます。これは、9または10ヌクレオチドの短いプライマー（「smalligos」）から拡張できます。この手法により、PCRはより小さなプライマーに関連する領域をターゲットにすることができ、16S（または真核生物の18S）rRNA遺伝子などの保存されたDNA配列を増幅するために使用されます。
多重ライゲーション依存プローブ増幅（MLPA): 1対のプライマーのみで複数のターゲットを増幅できるため、マルチプレックスPCRの解像度の制限を回避できます。
マルチプレックスPCRさまざまなDNA配列に特異的なさまざまなサイズのアンプリコンを取得するために、1つのPCR混合物に含まれる複数のプライマーセットで構成されています。同時に複数の遺伝子に焦点を当てることにより、1回のテストで追加情報を取得することができます。そうしないと、数倍の試薬と完了までの時間が必要になります。各プライマーセットのアニーリング温度は、単一の反応内でアンプリコンサイズで正しく機能するように最適化する必要があります。つまり、それらの塩基対の長さは、ゲル電気泳動で視覚化したときに明確なバンドを形成するために十分に異なっている必要があります。
ネストされたPCR：非特異的DNA増幅によるバックグラウンドを低減することにより、DNA増幅の特異性を高めます。 2セットのプライマーが2つの連続したPCRで使用されます。最初の反応では、1対のプライマーを使用してDNA産物を合成します。これは、意図された目的に加えて、非特異的に増幅されたDNAフラグメントで構成されている場合があります。次に、生成物は、結合部位が最初の反応で使用された各プライマーの3 '末端と完全にまたは部分的に異なるプライマーセットを使用した2番目のPCRで使用されます。ネストされたPCRは、多くの場合、長いDNAフラグメントを特異的に増幅するよりも成功します。従来のPCRですが、ターゲット配列に関するより詳細な知識が必要です。
拡張機能が重複しているPCRまた 重複する拡張機能を使用したスプライシング（SOE）：相補的な配列を含む2つ以上のDNAを結合するために使用される遺伝子工学技術。配列または突然変異を調節する遺伝子を含むDNAの断片を接続するために使用されます。この技術により、特定の長いDNAコンストラクトを作成できます。
定量的PCR（QPCR）： PCR産物の量を測定するために使用されます（通常はリアルタイムで）。 DNA、cDNAまたはRNAの初期量を定量化します。 qPCRは、サンプル中のDNA配列の存在と、サンプル中のそのコピー数を決定するために広く使用されています。リアルタイム定量PCRは非常に高い精度を持っています。 QRT-PCR（またはQF-PCR）法では、Sybr Green、EvaGreenなどの蛍光色素、またはTaqManなどのフルオロフォアを含むDNAプローブを使用して、増幅産物の量をリアルタイムで測定します。 RT-PCR（リアルタイムPCR）またはRQ-PCRと呼ばれることもあります。 QRT-PCRは通常、qPCRと組み合わせて使用されることが多い逆転写PCRを指すため、QRT-PCRまたはRTQ-PCRがより適切な略語です。
逆転写PCR（RT-PCR）： RNAからのDNAのコピー数を増やすため。逆転写酵素はRNAをcDNAに転写し、cDNAはPCRによって増幅されます。 RT-PCRは、遺伝子発現を検出したり、転写開始部位と停止部位を含むRNA転写産物の配列を決定したりするために、発現プロファイリングで広く使用されています。遺伝子のゲノムDNA配列がわかっている場合は、RT-PCRを使用して遺伝子内のエクソンとイントロンの位置をマッピングできます。遺伝子の5 '末端（転写開始部位に対応）は通常、RACE-PCR（cDNA末端の迅速な増幅）によって決定されます。
固相PCR：「PoloniaAmplification」（たとえば、PCRコロニーがゲルマトリックス上に作成される）、「Bridge PCR」（プライマーが固体支持体表面に共有結合される）、従来の固相PCR（「非対称PCR」）など、いくつかの意味をカバーします。 "は、水性プライマーの1つに対応する配列を持つ固体支持体を持つプライマーの存在下で使用されます）、および強化された固相PCR（従来の固相PCRは、高Tmおよびネストされた固体支持体プライマーを使用することで改善できます）しっかりとしたサポートでプライマーの形成を促進するための熱「ステップ」を適用するオプション）。
熱非対称インターリーブPCR（TAIL-PCR）：既知のシーケンスに続く未知のシーケンスを分離するために使用されます。既知のシーケンスでは、TAIL-PCRは異なるアニーリング温度のプライマーのネストされたペアを使用します。プライマー縮重は、未知の配列とは異なる方向に増幅するために使用されます。
タッチダウンPCR（ステップPCR）： PCRサイクルが進むにつれてアニーリング温度を徐々に下げることにより、非特異的なバックグラウンドを減らすことを目的としたPCRバリアント。最初のサイクルでのアニーリング温度は、通常、使用されるプライマーのTmよりも数度（3〜5°C）高くなりますが、後のサイクルでは、温度は、プライマー。より高い温度はプライマー結合に対してより特異性を与え、より低い温度は初期サイクル中に生成された特定の産物からのより効率的な増幅を可能にします。
PAN-AC：増幅に等温条件を使用し、生細胞に適用できます。
ゲノムのユニバーサルクイックウォーク：メカニズムにより、従来の「片面」アプローチ（1つの遺伝子特異的プライマーと1つの共通プライマーのみを使用-人為的な「ノイズ」につながる可能性がある）よりも特異的な「両面」PCRを使用したゲノムウォーキングおよび遺伝子フィンガープリンティング、なげなわ構造の形成を含む。 UFWの簡略化された派生物は、「レーンRAGE」（ゲノムDNA末端の迅速な増幅のための投げ縄ネストPCR）、「5」RACEレーンおよび「3」RACEレーンです。
のインシリコPCR（デジタルPCR、仮想PCR、e-PCR、e-PCR）は、シーケンスされたゲノムまたはトランスクリプトームからDNA配列を増幅するために、特定のプライマー（プローブ）のセットを使用して理論的なポリメラーゼ連鎖反応の結果を計算するために使用される計算ツールを指します。

PCRの歴史

1971年のJournalof Molecular Biologyの記事で、Kleppe et al。は、酵素アッセイを使用して、invitro条件下でプライマーを使用して短いDNAテンプレートを複製する方法を最初に説明しました。しかし、PCRの基本原理のこの初期の発現はあまり注目されておらず、1983年のポリメラーゼ連鎖反応の発明は一般的にCareyMullisの功績によるものです。

Mullisが1983年にPCRを開発したとき、彼はカリフォルニア州エメリービルで初期のバイオテクノロジー企業であるCetusCorporationで働いていました。そこで彼は短いDNA鎖の合成を担当しました。 Mullisは、ある夜、車で太平洋岸の高速道路を運転しているときにPCRを考案したと書いています。彼は、DNAポリメラーゼによって引き起こされる複製の繰り返しサイクルを通じて、DNAの任意のセクションのコピー数を増やす方法を代わりに発明したことに気付いたとき、DNAの変化（突然変異）を分析する新しい方法を頭に入れました。 Scientific Americanで、Mullisは手順を次のように要約しています。「DNA遺伝物質の単一分子から始めて、PCRは1日で1,000億のそのような分子を生成することができます。この反応は簡単に実行できます。必要なのは、試験管、いくつかの簡単な試薬、および熱源だけです。」彼は1993年に彼の発明でノーベル化学賞を受賞しました。7年後、彼とCetusの同僚が彼の提案を初めて実行に移しました。しかし、他の科学者がマリスの研究に知的かつ実践的に貢献したこと、そして彼がPCR原理の唯一の発明者であったかどうかについては、いくつかの論争が残っています。

PCR法は、各複製サイクル後にDNA二重らせんの2本のDNA鎖を切断するために必要な> 90°C（194°F）の高温に耐えることができる適切なDNAポリメラーゼの使用に基づいています。もともとinvitro実験に使用され、PCRによって予見されたDNAポリメラーゼは、そのような高温に耐えることができませんでした。したがって、初期のDNA複製手順は非常に非効率的で時間がかかり、プロセス全体で大量のDNAポリメラーゼと連続処理が必要でした。

1976年に好熱性細菌から分離されたDNAポリメラーゼであるTaqポリメラーゼが発見されました。 サーマス水生生物温泉などの温泉（50〜80°C（122〜176°F））の環境に自然に生息する、PCR法の劇的な改善への道を開いた。から単離されたDNAポリメラーゼ T。Aquaticusは、高温で安定しており、DNA変性後も活性を維持するため、各サイクルの後に新しいDNAポリメラーゼを追加する必要がありません。これにより、サーマルサイクラーに基づくDNA増幅のプロセスを自動化することが可能になりました。

特許戦争

提案されたPCR法は、Carey Mullisが特許を取得しており、1983年にMullisがこの技術を発明したときに働いていたCetusCorporationの功績によるものです。 Taqポリメラーゼ酵素も特許によって保護されています。 DuPontが提起した不成功の訴訟を含む、方法論に関連するいくつかの注目を集める訴訟がありました。製薬会社Hoffmann-LaRocheは、1992年に特許の権利を取得し、現在も保護されている特許を保有しています。

Taqポリメラーゼ酵素をめぐる同様の特許争いは、ロシュとプロメガの間の世界中のいくつかの法域でまだ続いています。法的な議論は、2005年3月28日に失効した元のPCRおよびTaqポリメラーゼ特許の条件を超えていました。

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）-合成オリゴヌクレオチドプライマーによって誘導される核酸の特異的増幅である分子生物学の実験的方法 試験管内で。

PCR法を開発するというアイデアは、1983年に人工条件下でDNAポリメラーゼ酵素を使用して周期的倍加中にDNAを増幅することを可能にする方法を作成したアメリカの研究者KaryMullisに帰属します。このアイデアが発表されてから数年後の1993年、K。マリスはノーベル賞を受賞しました。

この方法の使用開始時、各加熱-冷却サイクルの後、反応混合物は高温で急速に不活性化されるため、反応混合物にDNAポリメラーゼを添加する必要がありました。手順は非常に非効率的で、多くの時間と酵素を必要としました。 1986年に、それは好熱性細菌からのDNAポリメラーゼを使用することによって大幅に変更されました。これらの酵素は多くの反応サイクルに耐えることができるため、PCRを自動化できます。最も一般的に使用されている熱安定性DNAポリメラーゼの1つは、細菌から分離されています。 サーマスアクアティカスと名前が付けられました Taq-DNAポリメラーゼ。

メソッドの本質。この方法は、酵素Taq-DNAポリメラーゼを使用した特定のDNA領域の複数の選択的コピーに基づいています。ポリメラーゼ連鎖反応により、最大数千塩基対の長さの増幅産物を得ることが可能になります。 PCR産物の長さを2万から4万塩基対に増やすために、さまざまなポリメラーゼの混合物が使用されますが、それでも真核細胞の染色体DNAの長さよりはるかに短いです。

反応はプログラム可能なサーモスタット（アンプ）で実行されます-十分に速く実行できるデバイス

試験管の冷却と加熱（通常、少なくとも0.1°Cの精度で）。アンプを使用すると、「ホットスタート」やその後のストレージの可能性があるプログラムなど、複雑なプログラムを設定できます。リアルタイムPCRの場合、蛍光検出器を備えたデバイスが製造されます。自動蓋とマイクロプレートコンパートメントを備えた機器も利用できるため、自動システムに統合できます。

通常、PCR中に20〜45サイクルが実行され、各サイクルは、変性、プライマーアニーリング、伸長の3つの段階で構成されます（図6.1および6.2）。イチジクに 6.1は、PCRサイクル中の試験管内の温度変化のダイナミクスを示しています。

米。 6.1。ポリメラーゼ連鎖反応の1サイクル中の試験管内の温度変化のグラフ

DNAテンプレートの変性 DNA鎖が分散するように反応混合物を94-96°Cに5-90秒間加熱することによって実行されます。最初のサイクルの前に、反応混合物を2〜5分間予熱して、初期マトリックスを完全に変性させます。これにより、非特異的な反応生成物の量を減らすことができます。

米。 6.2。ポリメラーゼ連鎖反応の最初のサイクルのスキーム

プライマーアニーリング段階。温度が徐々に下がると、プライマーはテンプレートに相補的に結合します。アニーリング温度はプライマーの組成に依存し、通常、計算された融解温度よりも4〜5℃低くなります。ステージの期間は5〜60秒です。

次の段階で- 伸長-母体のマトリックス上にDNAの娘鎖の合成があります。伸長温度はポリメラーゼに依存します。一般的に使用されるTaqおよびPfuDNAポリメラーゼは、72°Cで最も活性があります。伸長時間は、主にPCR産物の長さに依存し、通常、1000塩基対あたり1分です。

連邦教育庁

州の教育機関

高等専門教育

「カレリスカヤ州立教育アカデミー」

トピックに関するコースワーク：

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）とその応用

完成者：学生Koryagina Valeria Alexandrovna

チェック：Karpikova Natalya Mikhailovna

ペトロザボーツク2013

序章

第1章文献レビュー

1.5.4プラトー効果

1.5.6増幅

結論

序章

過去20年間は、生物学、医学、および農学への分子遺伝学的手法の広範な導入によって特徴づけられてきました。

1970年代初頭までに、分子生物学はある程度完全に達したように見えました。この間、微生物は分子遺伝学研究の主な対象でした。真核生物への移行は、当時存在していた遺伝子解析の方法では解決できないまったく新しい問題を研究者にもたらしました。分子遺伝学の開発におけるブレークスルーは、新しい実験ツールである制限エンドヌクレアーゼの出現により可能になりました。その後、質的に異なるアプローチに基づく直接DNA分析法の数が急速に増加し始めました。

多くの場合、現代の技術は、さまざまな生物の核および核外ゲノムの微細な構造的および機能的組織をより深いレベルで研究し始めることを可能にしました。これは、診断と治療の新しい方法の開発にとって特に重要でした。さまざまな病気。集団生物学と繁殖における分子遺伝学の成果を使用して、集団、品種、系統の遺伝的多様性を特定および分析し、経済的に価値のある個体を特定および認定し、遺伝子組み換え生物を作成し、その他の問題を解決する可能性も同様に重要でした。

それぞれの方法には、独自の長所と短所があります。いいえ普遍的な方法、発生するすべての問題を解決できます。したがって、進行中の研究のための特定の方法の選択は、あらゆる科学的研究の最も重要な段階の1つです。

第1章文献レビュー

1.1ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の発見の歴史

1983年にK.B. Mullis et al。は、核酸の研究と応用のすべての分野に大きな影響を与える運命にあるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を発表し、特許を取得しました。分子生物学と遺伝学のためのこの方法の重要性は非常に素晴らしく明白であることが判明したので、7年後に著者はノーベル化学賞を受賞しました。

この方法の使用開始時、各加熱-冷却サイクルの後、DNAポリメラーゼは、DNAらせん鎖を分離するために必要な高温で不活性化されたため、反応混合物に添加する必要がありました。反応手順は比較的非効率的であり、多くの時間と酵素を必要とした。 1986年に、ポリメラーゼ連鎖反応法が大幅に改善されました。好熱性細菌由来のDNAポリメラーゼを使用することが提案されています。これらの酵素は熱安定性であることが証明され、多くの反応サイクルに耐えることができました。それらを使用することで、PCRを簡素化および自動化することが可能になりました。最初の耐熱性DNAポリメラーゼの1つが細菌から分離されました サーマスアクアティカスと名前が付けられました Taq-ポリメラーゼ。

ヌクレオチド配列がわかっている任意のDNAセグメントを増幅し、PCRの完了後に均一な形で、調製量でそれを取得する可能性により、PCRが作成されます。別の方法短いDNAフラグメントの分子クローニング。この場合、従来のクローニングの遺伝子工学で使用されている複雑な方法論的手法を適用する必要はありません。 PCR法の開発により、分子遺伝学、特に遺伝子工学の方法論的可能性が大幅に拡大し、その分野の多くの科学的可能性が根本的に変化し、強化されました。

1.2ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の種類

· ネストされたPCR-反応の副産物の数を減らすために使用されます。 2対のプライマーを使用し、2つの連続した反応を実行します。プライマーの2番目のペアは、最初の反応の産物内のDNA領域を増幅します。

· 逆PCR-目的のシーケンス内の小さな領域のみがわかっている場合に使用されます。この方法は、DNAがゲノムに挿入された後に隣接する配列を決定する必要がある場合に特に役立ちます。インバーテッドPCRを実施するために、制限酵素を使用して一連のDNAカットを実行します。<#"justify">ポリメラーゼ連鎖反応プライマー

· グループ特異的PCR-親戚のPCR<#"center">1.3ポリメラーゼ連鎖反応

1980年代半ばに発見されたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、数時間以内に元のサンプルのコピー数を数百万回増やすことができます。反応の各サイクル中に、元の分子から2つのコピーが形成されます。合成された各DNAコピーは、次のサイクルで新しいDNAコピーを合成するためのテンプレートとして機能します。したがって、サイクルを繰り返すと、コピー数が指数関数的に増加します。計算の結果、30サイクルであっても、元の分子のコピー数は10億を超えることになります。各サイクルですべてのアンプリコンが複製されるわけではないことを考慮しても、それにもかかわらず、コピーの総数はかなり大きな数字になります。

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の各サイクルは、次の手順で構成されます。

· 変性-温度が上昇すると、二本鎖DNA分子がほどけて、2本の一本鎖DNA分子に分裂します。

· アニーリング-温度を下げると、プライマーがDNA分子の相補領域に付着できるようになります。

· 伸長-酵素DNAポリメラーゼが相補鎖を完成させます。

選択したフラグメントの増幅には、特定のDNA領域に隣接する2つのオリゴヌクレオチドプライマー（シード）を使用します。プライマー指向3 -互いに向かって、増幅する必要のあるシーケンスの方向で終了します。 DNAポリメラーゼは、プライマーから始めて、相互に相補的なDNA鎖の合成（完成）を行います。 DNA合成中、プライマーは新しく合成されたDNA分子の鎖に物理的に挿入されます。プライマーの1つを使用して形成されたDNA分子の各鎖は、他のプライマーを使用して相補的DNA鎖を合成するためのテンプレートとして機能します。

1.4ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の実施

ポリメラーゼ連鎖反応は、使用されているサーマルサイクラー（増幅器）とサイズが互換性のある特別な薄壁ポリプロピレン試験管で実行されます-ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の段階の温度と時間の特性を制御するデバイス。

1.5ポリメラーゼ連鎖反応法の原理

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、特定のDNA配列を数時間以内に何十億回も分離して増殖させることができるin vitroDNA増幅法です。ゲノムの1つの厳密に定義された領域の膨大な数のコピーを取得する機能により、既存のDNAサンプルの研究が大幅に簡素化されます。

ポリメラーゼ連鎖反応を実行するには、いくつかの条件が満たされている必要があります。

1.5.1反応混合物中のいくつかの成分の存在

反応（PCR）混合物の主成分は、Tris-HCl、KCl、MgClです。 2、ヌクレオチド三リン酸（ATP、GTP、CTP、TTP）、プライマー（オリゴヌクレオチド）の混合物、分析されたDNA調製、熱安定性DNAポリメラーゼ。反応混合物の各成分は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に直接関与し、試薬の濃度は増幅の過程に直接影響します。

· Tris-HCl-反応混合物のpHを決定し、バッファー容量を作成します。 DNAポリメラーゼの活性は培地のpHに依存するため、pHの値はポリメラーゼ連鎖反応の過程に直接影響します。通常、pH値は8〜9.5の範囲です。 pHが高いのは、温度が上昇すると、Tril-HClバッファーのpHが低下するためです。

· KCl-50 mmまでの塩化カリウムの濃度は、変性とアニーリングのプロセスの過程に影響を与えます。50mmを超える濃度は、DNAポリメラーゼを阻害します。

· MgCl 2-DNAポリメラーゼはMgであるため 2+-依存性酵素、マグネシウムイオンの濃度は酵素の活性に影響を与えます（Mg 2+NTPと複合体を形成します-ポリメラーゼの基質となるのはこれらの複合体です）。高濃度は非特異的増幅の増加につながり、低濃度は反応の阻害につながります。最適な濃度は（さまざまなポリメラーゼに対して）0.5〜5mMの範囲です。さらに、マグネシウム塩の濃度は、変性およびアニーリングプロセスの過程に影響を与えます-Mgの濃度の増加 2+DNAの融解温度（つまり、二本鎖DNA鎖の50％が一本鎖に切断される温度）の上昇を引き起こします。

· NTP-ヌクレオチド三リン酸は、核酸の直接モノマーです。鎖の終結を防ぐために、4つのヌクレオチド三リン酸すべての等しい比率が推奨されます。反応混合物中のこれらの成分の濃度が低いと、相補的DNA鎖の構築におけるエラーの可能性が高くなります。

· プライマー-最も最適なのは、融点差が2〜4以下のプライマーを使用することです。 o C.時々4の温度での長期貯蔵の間に o 多数の凍結-解凍後、またはその後、プライマーは二次構造-二量体を形成し、PCRの効率を低下させます。この問題の解消は、ウォーターバスでのインキュベーションに還元されます（T = 95 o C）3分間、その後0°まで急冷と。

· DNA調製物-DNA調製物（マトリックス）の量と質は、ポリメラーゼ連鎖反応の過程とパラメーターに直接影響します。過剰なDNAサンプルは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を阻害します。 DNA調製物中のさまざまな物質の不純物も、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の効率を低下させる可能性があります：酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、イソプロパノール、エタノール、ヘパリン、フェノール、尿素、ヘモグロビンなど。

· DNAポリメラーゼ-少量のDNAポリメラーゼを使用すると、フラグメントのサイズに正比例して最終生成物の合成の減少が観察されます。ポリメラーゼが2〜4倍過剰になると、拡散スペクトルが現れ、4〜16倍過剰になると低分子量の非特異的スペクトルが現れます。使用する濃度の範囲は、25 µlのPCR混合物に対して0.5〜1.5単位の活性です。

PCR混合物の主成分に加えて、PCRの定性的および定量的指標を改善する多くの追加の物質が使用されます。アセトアミド（5％）-主成分の溶解度の増加。ベタイン（ナトリウム塩）-DNAポリメラーゼの安定化、DNAの融点の低下、融点の均一化。ウシアルブミン（10-100μg/ ml）-DNAポリメラーゼの安定化; ジメチルスルホキシド（1-10％）-主成分の溶解度を高めます。ホルムアミド（2-10％）-アニーリングの特異性の増加; グリセロール（15-20％）-酵素の熱安定性の増加、DNAサンプルの変性温度の低下; 硫酸アンモニウム-変性とアニーリングの温度を下げます。

1.5.2サイクルと温度

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プログラムの一般的な見方は次のとおりです。

ステージ。 DNA調製物の一次変性の延長。1サイクル

ステージ。 DNA調製物の急速な変性。プライマーアニーリング。伸び.30-45サイクル。

ステージ。延長された伸び。反応混合物の冷却。1サイクル。

ステージの各要素（変性、アニーリング、伸長）には、個別の温度と時間の特性があります。各要素の温度とフロー時間のパラメーターは、増幅産物の定性的および定量的指標に従って、経験的に選択されます。

変性。ポリメラーゼ連鎖反応のこの要素の間に、二本鎖DNA分子は2つの一本鎖のものに分割されます。変性の温度パラメータは90〜95の範囲です o C、ただしDNAサンプルの場合素晴らしいコンテンツグアニンとシトシン、温度を98に上げる必要があります o C.変性の温度は、完全に変性するのに十分でなければなりません。DNA鎖を切断し、「突然の冷却」や急速なアニーリングを避けますが、熱安定性DNAポリメラーゼは高温では安定性が低くなります。したがって、プライマー/サンプル比（DNA調製）に最適な変性温度パラメーターを選択することは、増幅の重要な条件です。最初のステップの変性温度が95を超える場合 o C、一次変性後に反応混合物にDNAポリメラーゼを加えることをお勧めします。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）中の段階のこの要素の持続時間は、完全なDNA変性に十分である必要がありますが、同時に、特定の温度でのDNAポリメラーゼの活性に大きな影響を与えることはありません。

アニーリング。アニーリング温度（T a ）は、ポリメラーゼ連鎖反応の最も重要なパラメーターの1つです。各特定のプライマーのアニーリング温度は個別に選択されます。プライマーの長さとヌクレオチド組成に依存します。通常は2〜4低くなります o 融点値から（T m ）プライマー。システムのアニーリング温度が最適値を下回ると、非特異的に増幅されたフラグメントの数が増加し、逆に、より多くの熱増幅産物の量を減らします。この場合、特定のアンプリコンの濃度は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の阻害まで、急激に減少する可能性があります。アニーリング時間を長くすると、非特異的なアンプリコンの数も増えます。

伸長。通常、各タイプの熱安定性DNAポリメラーゼには、活性に最適な個別の温度があります。酵素による相補的DNA鎖の合成速度も、各ポリメラーゼに固有の値であるため（平均して、1秒あたり30〜60ヌクレオチド、または1分あたり1〜2千塩基）、伸長時間は以下に応じて選択されます。 DNAポリメラーゼの種類と増幅領域の長さについて。

1.5.3プライマー選択の基本原則

PCRテストシステムを作成する場合、主なタスクの1つは、いくつかの基準を満たす必要があるプライマーを正しく選択することです。

プライマーは具体的でなければなりません。特別な注意 3を支払う -プライマーの末端。Taqポリメラーゼが相補的DNA鎖を完成させ始めるのはそれらからです。それらの特異性が不十分な場合、反応混合物を含む試験管内で望ましくないプロセス、すなわち非特異的DNA（短いまたは長いフラグメント）の合成が発生する可能性があります。電気泳動では、重いまたは軽い追加のバンドの形で表示されます。これは、特定の増幅産物を合成された外来DNAと混同しやすいため、反応の結果を評価することを困難にします。プライマーとdNTPの一部は、非特異的DNAの合成に消費されるため、感度が大幅に低下します。

プライマーは二量体とループを形成するべきではありません。プライマーをそれ自体または互いにアニーリングすることによって安定した二本鎖が形成されるべきではありません。

1.5.4プラトー効果

特定の増幅産物の蓄積プロセスは、限られた時間しかかからず、その効率が大幅に低下することに注意してください。これは、いわゆる「プラトー」効果によるものです。

期間効果高原増幅の最後のサイクルでのPCR産物の蓄積プロセスを説明するために使用されます。

増幅反応の条件とサイクル数に応じて、効果が達成される時点で高原基質（dNTPおよびプライマー）の利用、反応物（dNTPおよび酵素）の安定性、ピロリン酸およびDNA二重鎖を含む阻害剤の数、非特異的生成物またはプライマーダイマーとの反応物の競合、特定の生成物の濃度、および高濃度の増幅産物での不完全な変性。

ターゲットDNAの初期濃度が低いほど、反応のリスクが高くなります。プラトー」。このポイントは、特定の増幅産物の数が分析に十分になる前に発生する可能性があります。これを回避できるのは、十分に最適化されたテストシステムのみです。

1.5.5生物学的材料のサンプル準備

タスクに応じて、DNA抽出にはさまざまな手法が使用されます。それらの本質は、生物学的産物からのDNAの抽出（抽出）と、PCRに適した純度のDNA調製物を得るための外来不純物の除去または中和にあります。

Marmurによって記述された純粋なDNA調製物を取得する方法は標準と見なされており、すでに古典的になっています。これには、酵素によるタンパク質分解とそれに続く除タンパクおよびアルコールによるDNAの再沈殿が含まれます。この方法により、純粋なDNA調製物を得ることができます。しかし、それは非常に骨の折れる作業であり、フェノールやクロロホルムなどの攻撃的で刺激的な物質を扱う必要があります。

現在人気のある方法の1つは、Boomらによって提案されたDNA抽出方法です。この方法は、細胞溶解のための強力なカオトロピック剤であるグアニジンチオシアン酸塩（GuSCN）の使用と、それに続く担体（ガラスビーズ、珪藻土、ガラスミルクなど）へのDNA収着に基づいています。洗浄後、キャリアに吸着したサンプルにDNAが残り、溶出バッファーを使用して簡単に除去できます。この方法は便利で、技術的に進歩しており、増幅のためのサンプル調製に適しています。ただし、キャリアへの不可逆的な収着、および多数の洗浄中にDNAが失われる可能性があります。特に非常に重要これは、サンプル中の少量のDNAを扱う場合に発生します。さらに、微量のGuSCNでもPCRを阻害する可能性があります。したがって、この方法を使用する場合、それは非常に重要です正しい選択吸着剤と技術的ニュアンスの注意深い遵守。

サンプル前処理方法の別のグループは、Chilexタイプのイオン交換体の使用に基づいています。これは、ガラスとは異なり、DNAを吸着しませんが、その逆の場合は、反応を妨げる不純物を吸着します。原則として、この技術には、サンプルの沸騰とイオン交換体への不純物の吸着という2つの段階があります。この方法は、実行が簡単なため、非常に魅力的です。ほとんどの場合、臨床材料での作業に適しています。残念ながら、イオン交換体を使用して除去できない不純物を含むサンプルが存在する場合があります。また、単純な煮沸では破壊できない微生物もあります。このような場合、サンプル処理の追加段階を導入する必要があります。

したがって、サンプル前処理方法の選択は、目的の分析の目的を理解した上で処理する必要があります。

1.5.6増幅

増幅反応を行うには、反応混合物を調製し、分析したDNAサンプルを加える必要があります。この場合、プライマーアニーリングのいくつかの機能を考慮することが重要です。事実は、原則として、分析された生物学的サンプルにはさまざまなDNA分子があり、反応に使用されるプライマーは部分的で、場合によっては重要な相同性を持っています。さらに、プライマーは互いにアニーリングしてプライマーダイマーを形成することができます。どちらも、副（非特異的）反応生成物を合成するためのプライマーを大量に消費し、その結果、システムの感度を大幅に低下させます。これにより、電気泳動中の反応結果を読み取ることが困難または不可能になります。

1.6標準的なPCR反応混合物の組成

x PCRバッファー（100 mM Tris-HCl溶液、pH 9.0、500 mM KCl溶液、25 mMMgCl2溶液）…….2.5µl

水（MilliQ）……………………………………………………….18.8 µl

ヌクレオチド三リン酸（dNTP）の混合物

それぞれのmM溶液…………………………………………。……….0.5µl

プライマー1（10 mM溶液）…………………………………………。….1µl

プライマー2（10 mM溶液）…………………………………………。….1µl

DNAポリメラーゼ（5ユニット/ µl）……………………………………………0.2 µl

DNAサンプル（20 ng / µl）…………………………………………..1 µl

1.7反応結果の評価

PCRの結果を正しく評価するためには、この方法が定量的ではないことを理解することが重要です。理論的には、単一のターゲットDNA分子の増幅産物は、30〜35サイクル後に電気泳動で検出できます。しかし、実際には、これは、人生であまり遭遇しない理想に近い条件下で反応が起こる場合にのみ行われます。 DNA調製物の純度は、増幅の効率に特に大きな影響を及ぼします。反応混合物中の特定の阻害剤の存在。これは、場合によっては取り除くのが非常に難しい場合があります。時には、それらの存在のために、何万もの標的DNA分子でさえ増幅することができない場合があります。したがって、多くの場合、ターゲットDNAの初期量と増幅産物の最終量の間に直接的な関係はありません。

第2章：ポリメラーゼ連鎖反応の応用

PCRは、分析や科学実験の多くの分野で使用されています。

法医学

PCRは、いわゆる「遺伝子指紋」を比較するために使用されます。犯罪現場からの遺伝物質のサンプルが必要です-血液、唾液、精液、髪の毛など。容疑者の遺伝物質と比較されます。理論的には、ごく少量のDNAで十分です-1コピー。 DNAは断片に切断され、PCRによって増幅されます。断片はDNA電気泳動によって分離されます。結果として得られるDNAバンドの位置の画像は、遺伝子指紋と呼ばれます。

父性の確立

PCRによって増幅されたDNAフラグメントの電気泳動の結果。父親。子。母親。子供は両親の遺伝的刷り込みのいくつかの特徴を継承し、それが新しい独特の刷り込みをもたらしました。

「遺伝的指紋」は独特ですが、そのような指紋をいくつか作成することで、家族の絆を築くことができます。わずかな変更を加えて同じ方法を適用して、生物間の進化的関係を確立することができます。

医療診断

PCRは、遺伝性および遺伝性の診断を大幅にスピードアップおよび促進することを可能にします。ウイルス性疾患。目的の遺伝子は、適切なプライマーを使用したPCRによって増幅され、その後、変異を決定するために配列決定されます。ウイルス感染症感染直後、病気の症状が現れる数週間または数ヶ月前に検出できます。

個別化医療

一部の患者にとって、薬は有毒またはアレルギー誘発性である場合があります。この理由の一部は、薬剤とその誘導体の感受性と代謝の個人差にあります。これらの違いは、遺伝子レベルで決定されます。たとえば、ある患者では、特定のシトクロムがより活性が高く、別の患者ではより活性が低い場合があります。特定の患者がどのような種類のシトクロムを持っているかを判断するために、薬剤を使用する前にPCR分析を実行することが提案されています。この分析は、予備的なジェノタイピングと呼ばれます。

遺伝子クローニング

遺伝子クローニングは、遺伝子を単離し、遺伝子工学的操作の結果として、特定の遺伝子の産物を大量に取得するプロセスです。 PCRは遺伝子を増幅するために使用され、次にベクター、同じ生物または成長しやすい別の生物に外来遺伝子を運ぶDNAの断片に挿入されます。ベクターとしては、例えば、プラスミドやウイルスDNAが使用されます。外来生物への遺伝子の挿入は、通常、この遺伝子の産物であるRNAまたはほとんどの場合タンパク質を得るために使用されます。このようにして、農業、医学などで使用するために多くのタンパク質が工業的な量で得られます。

DNAシーケンシング

蛍光標識またはジデオキシヌクレオチドの放射性同位体で標識された配列決定の方法では、蛍光または放射性標識で標識されたヌクレオチドの誘導体がDNA鎖に挿入されるのは重合中にあるため、PCRは不可欠な部分です。これにより反応が停止し、ゲル内で合成された鎖を分離した後、特定のヌクレオチドの位置を決定できるようになります。

突然変異誘発

現在、PCRは突然変異誘発の主な方法になっています。 PCRを使用することで、突然変異誘発手順を簡素化および高速化するだけでなく、信頼性と再現性を高めることができました。

PCR法により、この研究の40年前に、パラフィンに包埋されたヒト子宮頸部腫瘍の生検の切片におけるヒトパピローマウイルス配列の存在を分析することが可能になりました。さらに、PCRの助けを借りて、7000年の年齢の人間の脳の化石の残骸からミトコンドリアDNAの断片を増幅してクローン化することが可能でした！

個々のヒト精子の溶解物について、異なる非相同染色体上にある2つの遺伝子座を同時に分析する可能性が実証されました。このアプローチは提供しますユニークな機会微細な遺伝子解析と染色体組換え、DNA多型などの研究。半数体細胞のHLAタイピングにより父性を決定したり犯罪者を特定したりできるため、個々の精子を分析する方法は法医学ですぐに実用化されました（HLA複合体はヒトの主要な組織適合性複合体遺伝子のセット; HLA複合体の遺伝子座は、高等脊椎動物で知られているすべての中で最も多型です：種内では、各遺伝子座に、異常に多数の異なる対立遺伝子があります-同じ遺伝子の代替形態）。

PCRを使用して、研究対象の細胞のゲノムの所定の領域における外来遺伝子構造の統合の正確さを特定することが可能です。全細胞DNAは、2つのオリゴヌクレオチドプライマーでアニーリングされます。1つは挿入点近くの宿主DNA領域に相補的であり、もう1つは逆平行DNA鎖に組み込まれたフラグメントの配列に相補的です。提案された挿入部位での染色体DNAの構造が変化していない場合のポリメラーゼ連鎖反応は、不定のサイズの一本鎖DNAフラグメントの形成につながり、計画された挿入の場合、既知の二本鎖DNAフラグメントの形成につながります。サイズ。2つのプライマーのアニーリング部位間の距離によって決定されます。さらに、最初のケースでのゲノムの分析された領域の増幅の程度は、サイクル数に線形的に依存し、2番目のケースでは指数関数的に依存します。 PCR中に所定のサイズの増幅断片が指数関数的に蓄積することにより、DNA調製物の電気泳動分画後にそれを視覚的に観察し、染色体DNAの特定の領域への外来配列の挿入について明確な結論を出すことができます。

結論

PCR法は、現在、さまざまな感染症を診断する方法として最も広く使用されています。 PCRを使用すると、分析用に採取したサンプルに病原体のDNA分子がわずかしか含まれていない場合でも、感染の病因を特定できます。 PCRはで広く使用されています早期診断 HIV感染症ウイルス性肝炎等現在まで、PCRでは検出できない感染性病原体はほとんどありません。

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方法の原理（分子生物学的基礎）

DNA分析のための多種多様なハイブリダイゼーション法の中で、PCRは臨床検査診断で最も広く使用されています。

メソッドの原則 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（ポリメラーゼ連鎖反応（PCR））は、1983年にCary Mullis（Cetus、USA）によって開発されました。現在、科学研究と実際の医療における診断、および州の衛生疫学監督サービス（ジェノタイピング、感染症の診断）の両方に広く使用されています。

PCR法は、DNAポリメラーゼ酵素の助けを借りて実行される、DNAテンプレートの補完的な完成という自然なプロセスに基づいています。この反応はと呼ばれます DNA複製。

自然なDNA複製には、いくつかのステップが含まれます。

1) DNA変性（二重らせんの巻き戻し、DNA鎖の分岐）;

2) 短い二本鎖DNAセグメントの形成（DNA合成を開始するために必要なシード）;

3) 新しいDNA鎖の合成（両方のストランドの補完的な完了）

このプロセスは、コピーを取得するために使用できます 特定の微生物に特異的なDNAの短いセグメント、それらの。感染症の病原体を特定するための遺伝子診断の目標である、そのような特定の領域のターゲットを絞った検索を実行すること。

好熱性細菌からの耐熱性DNAポリメラーゼ（Taqポリメラーゼ）の発見 Thermis aquaticus最適なのは70-72°Cの領域であり、DNA複製のプロセスを周期的にし、invitroでの作業に使用することを可能にしました。与えられたプログラムに従って周期的な温度変化を実行するプログラム可能なサーモスタット（増幅器）の作成は、実験室での実践にPCR法を広く導入するための前提条件を作成しました。臨床診断。合成サイクルを繰り返すと、特定のDNA断片のコピー数が指数関数的に増加し、微生物の単一細胞を含む可能性のある少量の分析物質から十分な数のDNAコピーを取得できるようになります。、電気泳動によるそれらの同定のため。

鎖の相補的完成は、DNA配列のどの時点でも開始されませんが、特定の開始ブロック（短い二本鎖セクション）でのみ開始されます。このようなブロックをDNAの特定の領域に取り付けることにより、DNA鎖の全長に沿ってではなく、この領域でのみ新しい鎖の合成プロセスを指示することができます。特定のDNA領域にスターティングブロックを作成するには、2つのオリゴヌクレオチドプライマー（20ヌクレオチドペア）を使用します。 プライマー。プライマーは、特定のフラグメントの左右の境界にあるDNA配列に相補的であり、新しいDNA鎖の完成がそれらの間でのみ発生するように方向付けられています。

したがって、PCRは、DNAポリメラーゼ酵素によって触媒される特定のDNA領域のコピー数（増幅）の倍数の増加です。

増幅には以下の成分が必要です。

デオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）の混合物（新しい相補的DNA鎖の合成のための材料である4つのdNTPの混合物）

酵素Taqポリメラーゼ（合成されたDNAの成長する鎖にヌクレオチド塩基を順次追加することによってプライマー鎖の延長を触媒する熱安定性DNAポリメラーゼ）。

緩衝液（酵素活性を維持するために必要なMg2 +イオンを含む反応媒体）
RNA含有ウイルスのゲノムの特定の領域を決定するために、酵素逆転写酵素（逆転写酵素）によって触媒される逆転写（RT）反応を使用して、RNAテンプレートからDNAコピーを最初に取得します。

目的の特徴的なDNAフラグメントの十分な数のコピーを取得するために、増幅には数回（20〜40）のサイクルが含まれます。

各増幅サイクルには、異なる温度条件で進行する3つの段階が含まれます

ステップ1：DNA変性（二重らせんの巻き戻し）。それは93-95°Cで30-40秒間流れます。

ステージ2：プライマーの付着（アニーリング）。プライマーの付着は、特定の部位の境界にある反対側のDNA鎖の対応する配列に相補的に起こります。プライマーの各ペアには独自のアニーリング温度があり、その値は50〜65°Cの範囲です。アニーリング時間-20〜60秒。

ステージ3：DNAチェーンの構築。 DNA鎖の相補的な完成は、プライマーの付着部位から始めて、鎖の5 '末端から3'末端まで反対方向に起こります。新しいDNA鎖を合成するための材料は、溶液に添加されたデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTP）です。合成プロセスは、酵素熱安定性DNAポリメラーゼ（Taqポリメラーゼ）によって触媒され、70〜72℃の温度で行われます。合成時間-20〜40秒

最初の増幅サイクルで形成された新しいDNA鎖は、2番目の増幅サイクルのテンプレートとして機能し、目的の特定のDNAフラグメント（アンプリコン）が形成されます。（図2を参照）。その後の増幅サイクルでは、アンプリコンは新しい鎖を合成するためのテンプレートとして機能します。したがって、溶液中のアンプリコンの蓄積は、式2nに従って発生します。ここで、nは増幅サイクルの数です。したがって、最初の溶液に二本鎖DNA分子が1つしか存在しなかったとしても、30〜40サイクル後に約108個のアンプリコン分子が溶液に蓄積します。この量は、アガロースゲル電気泳動によるこのフラグメントの信頼できる視覚的検出に十分です。増幅プロセスは、特別なプログラム可能なサーモスタット（増幅器）で実行されます。このサーモスタットは、特定のプログラムに従って、増幅サイクル数に応じて温度を自動的に変更します。

PCRの段階-分析

ツールとしてのPCR法の中心実験室診断感染症は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して目的のフラグメントを蓄積することにより、この微生物にのみ特異的な病原体の小さなDNAフラグメント（数百塩基対）の検出にあります。
PCR法を使用した分析手法には、次の3つの段階があります。

1.臨床サンプルからのDNA（RNA）の分離

2.特定のDNAフラグメントの増幅
3.増幅産物の検出

DNA（RNA）の分離
分析のこの段階で、臨床サンプルは特別な処理にかけられ、細胞材料の溶解、タンパク質および多糖類画分の除去、およびDNAまたはRNA溶液の調製が行われます。
阻害剤とさらなる増幅の準備ができています。
DNA（RNA）抽出技術の選択は、主に処理された臨床材料の性質によって決定されます。

特定のDNAフラグメントの増幅
この段階で、短い特定のDNAフラグメントは、それらのさらなる検出に必要な量で蓄積されます。ゲノムの特定のフラグメントを決定するためのほとんどの方法は、いわゆるを使用します。「ガイド付きPCRのクラシックバージョン。分析の特異性と感度を高めるために、一部のメソッドでは、2ペアのプライマーを使用する「ネストされた」PCRメソッドを使用します（「外部」-第1ステージ、「内部」-第2ステージ）。

増幅産物の検出
ほとんどの技術では、この段階で、第2段階で得られた増幅産物の混合物が水平アガロースゲル電気泳動によって分離されます。電気泳動分離の前に、エチジウムブロマイド溶液を増幅混合物に添加します。これにより、二本鎖DNAフラグメントと強力な間質接合が形成されます。 UV照射の作用下にあるこれらの化合物は蛍光を発することができ、アガロースゲルで増幅混合物を電気泳動分離した後、オレンジレッドの発光バンドとして記録されます。

いくつかの欠点がある電気泳動検出法の代替として、結果を読み取る際の主観性、1回の反応でのさまざまな微生物のDNAの測定に対する制限を提案することができます。 ハイブリダイゼーション検出スキーム。これらのスキームでは、増幅から生じるDNAフラグメントは、特定のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズします（2本鎖複合体-「ハイブリッド」を形成します）。このような複合体の登録は、比色分析または蛍光測定で行うことができます。 SPC "Litekh"は、結果の蛍光登録とのハイブリダイゼーションに基づいて検出キットを作成しました

感染症を診断する方法としてのPCR法の利点：

-病原体の存在の直接検出

多くの従来の方法酵素免疫測定法などの診断は、感染性病原体の生命活動の産物であるマーカータンパク質を明らかにします。これは、感染の存在の間接的な証拠のみを提供します。 PCRによる病原体の特定のDNA領域の同定は、感染性病原体の存在を直接示します。

-高い特異性
PCR法の高い特異性は、この病原体にのみ特徴的な独特のDNA断片が試験物質で検出されるという事実によるものです。特異性は、プライマーのヌクレオチド配列によって決定されます。
交差反応性抗原のためにエラーが珍しくない酵素イムノアッセイ法とは対照的に、誤った結果を得る可能性。

- 高感度
PCR法では、細菌やウイルスの単一細胞でも検出できます。 PCR診断は、他の方法（免疫学的、細菌学的、
微視的）は不可能です。 PCR分析の感度はサンプルあたり10〜1000細胞です（免疫学的および顕微鏡検査の感度は103〜105細胞です）。

-さまざまな病原体を特定するための手順の普遍性
PCRによる研究の材料は病原体のDNAです。この方法は、特定の生物に特異的なDNAまたはRNAフラグメントの検出に基づいています。すべての核酸の化学組成の類似性により、実施のための統一された方法の使用が可能になります実験室研究。これにより、1つのバイオアッセイから複数の病原体を診断することが可能になります。さまざまな生物学的分泌物（粘液、尿、痰）、上皮細胞の削りくず、血液、血清を試験物質として使用できます。

-分析結果の高速取得
PCR分析では、病原体培養の分離と培養は必要ありません。たくさんの時間。生体材料の処理と反応生成物の検出のための統一された方法、および増幅プロセスの自動化により、4〜4.5時間で完全な分析を実行することが可能になります。

PCR法は、患者から得られた臨床材料だけでなく、環境物体（水、土壌など）から得られた材料からも病原体を検出できることに注意する必要があります。

実践的なヘルスケアにおけるPCR法の適用

細菌性とウイルス性の両方の感染症を診断するためのPCR法の使用は、微生物学と疫学の多くの問題を解決するために非常に重要です。この方法の使用はまた、慢性およびほとんど研究されていない感染症の分野における基礎研究の発展に貢献します。

この方法の最も効果的で経済的に正当化される使用法は次のとおりです。

泌尿生殖器の実践-クラミジア、尿素プラズマ症、淋病、ヘルペス、ガードネレロ症、マイコプラズマ感染を検出するため。

呼吸器学で- にとって鑑別診断ウイルス性および細菌性肺炎、結核;

胃腸病学で-ヘリコバクテリア症を検出するため。

感染症のクリニックで-サルモネラ症、ジフテリア、ウイルス性の診断のための明白な方法として B型肝炎、C型肝炎およびG;

血液学で-サイトメガロウイルス感染、腫瘍ウイルスを検出します。

1.ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）

2.ポリメラーゼ連鎖反応法の原理

2.1反応混合物中の多くの成分の存在

2.2温度サイクリング

2.3プライマー選択の基本原則

2.4プラトー効果

3.PCR設定の段階

3.2増幅

3.4.1ポジティブコントロール

3.4.2内部統制

4.1定性分析

4.1.2RNA分子の検出

3.1生物学的材料のサンプル準備

現在人気のある方法の1つは、Boomらによって提案されたDNA抽出方法です。この方法は、細胞溶解のための強力なカオトロピック剤であるグアニジンチオシアン酸塩（GuSCN）の使用と、それに続く担体（ガラスビーズ、珪藻土、ガラスミルクなど）へのDNA収着に基づいています。洗浄後、キャリアに吸着したサンプルにDNAが残り、溶出バッファーを使用して簡単に除去できます。この方法は便利で、技術的に進歩しており、増幅のためのサンプル調製に適しています。ただし、キャリアへの不可逆的な収着、および多数の洗浄中にDNAが失われる可能性があります。これは、サンプル中の少量のDNAを扱う場合に特に重要です。さらに、微量のGuSCNでもPCRを阻害する可能性があります。したがって、この方法を使用する場合、吸着剤を正しく選択し、技術的なニュアンスを注意深く遵守することが非常に重要です。

したがって、サンプル前処理方法の選択は、目的の分析の目的を理解した上で処理する必要があります。

3.2増幅

3.3反応結果の評価

3.3.1水平電気泳動法

増幅の結果を視覚化するために、さまざまな方法が使用されます。今日最も一般的なのは、サイズによるDNA分子の分離に基づく電気泳動の方法です。これを行うために、アガロースゲルのプレートを準備します。これは、特殊なDNA色素、たとえば臭化エチジウムを添加して、1.5〜2.5％の濃度で電気泳動バッファーで溶解した後にアガロースを凍結します。凍結したアガロースは空間格子を形成します。コームを使用して注ぐと、ゲル内に特別なウェルが形成され、その後増幅産物が追加されます。ゲルプレートを水平ゲル電気泳動装置に配置し、ソースを接続します定電圧。負に帯電したDNAは、ゲル内でマイナスからプラスに移動し始めます。同時に、短いDNA分子は長いものよりも速く動きます。ゲル内でのDNAの移動速度は、アガロースの濃度、電界強度、温度、電気泳動バッファーの組成、および程度は低いもののDNAのGC組成の影響を受けます。同じサイズのすべての分子は同じ速度で移動します。色素は、平面グループでDNA分子に埋め込まれます（挿入されます）。 10分から1時間続く電気泳動の終了後、ゲルは紫外線範囲（254-310 nm）の光を発するトランスイルミネーターのフィルター上に置かれます。 DNAが260nmで吸収したUVエネルギーは色素に伝達され、可視スペクトル（590 nm）のオレンジレッド領域で蛍光を発します。

増幅産物のバンドの明るさは異なる場合があります。ただし、これはサンプル中のターゲットDNAの初期量とは関係ありません。

3.3.2垂直電気泳動法

垂直電気泳動の方法は、基本的に水平電気泳動と似ています。それらの違いは、この場合、アガロースの代わりにポリアクリルアミドゲルが使用されるという事実にあります。垂直電気泳動専用のチャンバー内で行います。ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、アガロース電気泳動よりも分解能が高く、1ヌクレオチドの精度で異なるサイズのDNA分子を区別することができます。ポリアクリルアミドゲルの調製は、アガロースよりもやや複雑です。また、アクリルアミドは有毒物質です。増幅産物のサイズを1ヌクレオチドの精度で決定する必要が生じることはめったにないため、日常業務では水平電気泳動法が使用されます。

3.4増幅反応の進行状況のモニタリング

3.4.1ポジティブコントロール

「ポジティブコントロール」として、目的の微生物のDNA調製物を使用します。非特異的アンプリコンは、コントロールDNA調製物を用いた増幅によって生成されたアンプリコンとはサイズが異なります。非特異的製品のサイズは、ポジティブコントロールよりも大きくても小さくてもかまいません。最悪の場合、これらの寸法は一致する可能性があり、電気泳動で陽性として読み取られます。

得られた増幅産物の特異性を制御するために、酵素標識または放射性同位体で標識され、プライマーと同じ原理に従ってDNAと相互作用するハイブリダイゼーションプローブ（増幅可能な配列内に位置するDNA領域）を使用することができます。これにより、分析が非常に複雑になり、時間がかかり、コストが大幅に増加します。

3.4.2内部統制

反応混合物で各チューブの増幅の進行を制御する必要があります。この目的のために、追加のいわゆる「内部統制」が使用されます。これは、目的の微生物のDNAと類似していないDNAの調製物です。内部対照を反応混合物に加えると、それは、目的の感染性病原体の染色体DNAと同じプライマーアニーリングの標的になります。内部対照増幅産物のサイズは、微生物の標的DNAの増幅から生成されるアンプリコンの2倍以上になるように選択されます。その結果、内部対照DNAが試験サンプルと一緒に反応混合物に導入された場合、生物学的サンプル中の微生物の存在に関係なく、内部統制は特定のアンプリコンの形成を引き起こしますが、はるかに長く（より重い）微生物のアンプリコンより。反応混合物中に重いアンプリコンが存在することは、増幅反応の正常な経過と阻害剤の不在を示します。必要なサイズのアンプリコンが形成されなかったが、内部対照アンプリコンも形成されなかった場合、分析されたサンプルには除去すべき望ましくない不純物が含まれていると結論付けることができますが、目的のDNAが存在しないわけではありません。

残念ながら、このアプローチの魅力にもかかわらず、重大な欠陥があります。必要なDNAが反応混合物に存在する場合、プライマーの内部コントロールとの競合により、増幅の効率が急激に低下します。これは、テストサンプル中の低濃度のDNAで特に重要であり、偽陰性の結果につながる可能性があります。

それにもかかわらず、プライマーの競合の問題が解決されれば、増幅の効率を制御するこの方法は確かに非常に有用です。

4.ポリメラーゼ連鎖反応に基づく方法

4.1定性分析

PCRを設定する古典的な方法は、その原理が上で概説されており、PCRの限界を克服し、反応の効率を高めることを目的としたいくつかの修正で開発されました。

4.1.1「ホットスタート」を使用してPCRを設定する方法

増幅反応の非特異的生成物の形成のリスクを減らすために、「ホットスタート」と呼ばれるアプローチが使用されます。その本質は、チューブ内の特定のアニーリングを確実にする条件に達するまで反応を開始する可能性を防ぐことです。プライマー。

事実、HCの組成とサイズに応じて、プライマーには特定の融解温度（Tm）があります。システムの温度がTmを超えると、プライマーはDNA鎖に付着できなくなり、変性します。最適な条件下で、すなわち融解温度に近いアニーリング温度では、プライマーは完全に相補的である場合にのみ二本鎖分子を形成し、したがって反応の特異性を保証します。

「ホットスタート」を実装するには、さまざまなオプションがあります。

チューブを変性温度に加熱した後の最初のサイクルで、反応混合物にTaqポリメラーゼを導入します。

パラフィン層による反応混合物の成分の層への分離（下部のプライマー、上部のTaqポリメラーゼおよびターゲットDNA）。これは、パラフィンが溶けるときに混合されます（〜65-750С）。

Taqポリメラーゼに対するモノクローナル抗体の使用。モノクローナル抗体が結合した酵素は、モノクローナル抗体が不可逆的に変性し、Taqポリメラーゼの活性部位を放出する最初の変性段階の後でのみ活性になります。

これらすべての場合において、熱サイクルの開始前に非特異的アニーリングが起こったとしても、伸長は起こらず、プライマー-DNA複合体は加熱時に変性するため、非特異的生成物は形成されません。その後、チューブ内の温度が融点を下回らないため、特定の増幅産物が確実に形成されます。

4.1.2RNA分子の検出

PCRのターゲットとしてRNAを使用する可能性は、このメソッドのアプリケーションの範囲を大幅に拡大します。たとえば、多くのウイルス（C型肝炎、インフルエンザウイルス、ピコルナウイルスなど）のゲノムはRNAで表されます。同時に、ライフサイクルの中でDNAへの変換の中間段階はありません。 RNAを検出するには、最初にDNAの形に変換する必要があります。このために、2つから分離された逆転写酵素が使用されますさまざまなウイルス：トリ骨髄芽球症ウイルスおよびモロニーマウス白血病ウイルス。これらの酵素の使用は、いくつかの困難に関連しています。まず、熱に不安定であるため、42°Cを超えない温度で使用できます。この温度では、RNA分子が二次構造を形成しやすいため、反応効率が著しく低下し、さまざまな推定によれば、約5％です。逆転写酵素として、Mn 2+の存在下で転写酵素活性を示す好熱性微生物サーマス・サーモフィラスから得られた耐熱性ポリメラーゼを使用することにより、この欠点を回避する試みがなされています。これは、ポリメラーゼと転写酵素の両方の活性を示すことができる唯一の既知の酵素です。

逆転写反応を実行するには、PCRと同様に、反応混合物にシードとしてのプライマーと、構築材料としての4つのdNTPの混合物が含まれている必要があります。

逆転写反応後、得られたcDNA分子はPCRのターゲットとして機能します。

5.PCRを設定する技術的プロセスの組織

ポリメラーゼ連鎖反応の潜在的に高い感度により、PCRラボの特に注意深い設計が絶対に必要になります。これは、メソッドの最も深刻な問題である汚染によるものです。

汚染-外部環境から特定のDNA分子の反応混合物に侵入し、増幅反応のターゲットとして機能し、偽陽性の結果をもたらす可能性があります。

この不快な現象に対処する方法はいくつかあります。それらの1つは、酵素N-ウラシルグリコシラーゼ（UG）の使用です。この方法は、ウラシルが埋め込まれたDNA分子を切断するUGの能力に基づいています。増幅反応は、dTTPがウラシルに置き換えられたdNTP混合物を使用して実行され、熱サイクリング後、チューブ内に形成されたすべてのアンプリコンにウラシルが含まれます。増幅前にHCを反応混合物に加えると、反応混合物に入るアンプリコンは破壊されますが、ネイティブDNAは無傷のままで、その後増幅のターゲットとして機能します。

したがって、この方法は汚染源をある程度排除するだけであり、誤検知の結果を保証するものではありません。

汚染の結果に対処する別の方法は、反応サイクルの数を大幅に減らすことです（最大25〜30サイクル）。しかし、このアプローチでも、偽陽性の結果が得られるリスクは高くなります。この場合、阻害剤がないと、コンタミネーションにより増幅産物が得られやすいためです。

したがって、偽陽性の結果を引き起こすDNA分子を不活性化することを目的とした前増幅措置の利点にもかかわらず、最も根本的な救済策は、研究室のよく考えられた組織です。

結論

PCR法は、現在、さまざまな感染症を診断する方法として最も広く使用されています。 PCRを使用すると、分析用に採取したサンプルに病原体のDNA分子がわずかしか含まれていない場合でも、感染の病因を特定できます。 PCRは、HIV感染症、ウイルス性肝炎などの早期診断に広く使用されています。現在まで、PCRでは検出できない感染性病原体はほとんどありません。