تورم في الرأس

منهجية PCR. PCR (تفاعل البلمرة المتسلسل). كيف يتم إجراء تشخيص PCR ، المؤشرات ، كيفية الاستعداد للدراسة ، نتيجة PCR. تحليل PCR - ما هو

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)هي طريقة للتكنولوجيا الكيميائية الحيوية في البيولوجيا الجزيئية ، ويتم تنفيذها بهدف زيادة نسخة واحدة أو أكثر من شظايا الحمض النووي بعدة درجات ، مما يجعل من الممكن إنشاء من عدة آلاف إلى ملايين النسخ من تسلسل DNA محدد.

تم تطوير PCR في 1983 بواسطة Carey Mullis ، وهو الآن طريقة شائعة ولا غنى عنها في كثير من الأحيان تستخدم في مختبرات الأبحاث الطبية والبيولوجية للعديد من التطبيقات المختلفة. وتشمل هذه استنساخ الحمض النووي للتسلسل ، والتطور القائم على الحمض النووي ، أو تحليل الجينات الوظيفية ؛ تشخيص الأمراض الوراثية. تحديد البصمات الجينية (المستخدمة في فروع الطب الشرعي وإجراء اختبار الأبوة) ، وكذلك تحديد وتشخيص الأمراض المعدية. في عام 1993 ، مُنح موليس جائزة نوبل في الكيمياء مع مايكل سميث لعملهما في PCR.

تعتمد الطريقة على التدوير الحراري ، الذي يتكون من دورات التسخين والتبريد المتكررة للتفاعل من أجل التمسخ وتكرار الحمض النووي بواسطة الإنزيمات. الاشعال ، (أجزاء قصيرة من الحمض النووي) تحتوي على متواليات مكملة للموقع المستهدف مع بوليميراز الحمض النووي (الذي سميت منه الطريقة) ، هي مكونات رئيسية لتحريك الانتقائي وإعادة التضخيم. في عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يتم استخدام الحمض النووي نفسه كقالب للنسخ المتماثل ، مما يؤدي إلى بدء تفاعل متسلسل يتم فيه تضخيم قالب الحمض النووي بشكل كبير. يمكن تعديل PCR بشكل كبير لأداء مجموعة واسعة من التلاعب الجيني.

تستخدم جميع تطبيقات PCR تقريبًا بوليميراز DNA قابل للحرارة مثل Taq polymerase ، وهو إنزيم معزول في الأصل من البكتيريا ترمسأكواتيكوس... يقوم إنزيم بوليميراز الحمض النووي بتجميع إنزيمات جديدة من الكتل التي تشكل الحمض النووي - النيوكليوتيدات ، باستخدام الحمض النووي أحادي الجديلة كقالب وأوليغنوكليوتيدات الحمض النووي (تسمى أيضًا بادئات الحمض النووي) اللازمة لبدء تخليق الحمض النووي. تستخدم الغالبية العظمى من طرق PCR التدوير الحراري ، أي التسخين والتبريد البديل لعينة PCR وفقًا لسلسلة معينة من مراحل درجة الحرارة. خطوات التدوير الحرارية هذه مطلوبة أولاً للفصل المادي بين خيوط اللولب المزدوج للحمض النووي عند درجات حرارة عالية في عملية تسمى تمسخ الحمض النووي. عند درجة حرارة منخفضة ، سيتم استخدام كل حبلا كقالب في تخليق بوليميريز الحمض النووي من أجل تضخيم منطقة الحمض النووي المستهدفة بشكل انتقائي. انتقائية نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات التكميلية لمنطقة الحمض النووي - الهدف للتضخيم في ظل ظروف معينة من التدوير الحراري.

مبادئ تشخيص PCR

يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم جزء معين من خيط DNA (DNA الهدف). تعمل معظم طرق PCR عادةً على تضخيم شظايا الحمض النووي حتى 10000 زوج قاعدي (كيلو بايت) ، على الرغم من أن بعض الطرق يمكن أن تزيد من شظايا تصل إلى 40 كيلو بايت في الحجم. ينتج التفاعل كمية محدودة من المنتج المكبر النهائي ، والذي يتم تنظيمه بواسطة الكواشف المتاحة في التفاعل وتثبيط التغذية المرتدة لنواتج التفاعل.

تتطلب مجموعة PCR الأساسية عدة مكونات وكواشف. وتشمل هذه:

مصفوفة الحمض النوويتحتوي على منطقة الحمض النووي المستهدفة المراد تضخيمها.
اثنين من الاشعال ،مكمل للنهايات الثلاثة لكل من الخيوط الحسية والمضادة للدلالة في الحمض النووي المستهدف.
طاق بوليميرازأو بوليميريز DNA آخر يعمل عند درجة حرارة مثالية تبلغ حوالي 70 درجة مئوية.
ديوكسينوكليوزيد ثلاثي الفوسفات(dNTPs ؛ مجموعات ثلاثي الفوسفات تحتوي على نيوكليوتيدات) ، وهي اللبنات الأساسية التي يصنع منها بوليميراز الدنا خيطًا جديدًا من الحمض النووي.
محلول منظمتوفير الظروف الكيميائية المناسبة للنشاط الأمثل واستقرار بوليميريز الحمض النووي.
الكاتيونات ثنائية التكافؤأيونات المغنيسيوم أو المنغنيز ؛ عادةً ما يتم استخدام Mg2 + ، ولكن يمكن أيضًا استخدام Mn2 + في طفرات الحمض النووي بوساطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، حيث تزيد التركيزات الأعلى من Mn2 + معدل الخطأ أثناء تخليق الحمض النووي.
الكاتيونات أحادية التكافؤأيونات البوتاسيوم.

عادة ما يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في حجم تفاعل 10-200 ميكرولتر في أنابيب تفاعل صغيرة (0.2-0.5 مل) في مضخم تدوير حراري. يقوم مكبر الصوت بتسخين وتبريد أنابيب التفاعل لتحقيق درجات الحرارة المطلوبة لكل خطوة من خطوات التفاعل. تستخدم العديد من مكبرات الصوت الحديثة تأثير بلتيير ، والذي يسمح بتسخين كتلة من أنابيب PCR وتبريدها ببساطة عن طريق عكس اتجاه التيار الكهربائي. تعمل أنابيب التفاعل ذات الجدران الرقيقة على تعزيز التوصيل الحراري المناسب لضمان التوازن الحراري السريع. تتطلب أجهزة التدوير الحرارية القديمة التي لا تحتوي على غطاء ساخن طبقة من الزيت على سطح خليط التفاعل أو حبة من الشمع في أنبوب اختبار.

أمر إجراء

عادةً ما يتكون تفاعل البوليميراز المتسلسل من سلسلة من 20-40 تغيرًا متكررًا في درجات الحرارة ، تسمى دورات ، وتتكون كل دورة عادةً من 2-3 خطوات درجة حرارة منفصلة ، عادةً ثلاث خطوات. غالبًا ما يبدأ ركوب الدراجات وينتهي بمرحلة درجة حرارة واحدة (ما يسمى انتظار) عند درجة حرارة عالية (> 90 درجة مئوية) لتوسيع المنتج النهائي أو التخزين القصير. تعتمد درجات الحرارة المستخدمة وطول الفترة الزمنية التي يتم تطبيقها فيها في كل دورة على العديد من المعلمات. وتشمل هذه الإنزيم المستخدم في تصنيع الحمض النووي ، وتركيز الأيونات ثنائية التكافؤ و dNTPs في التفاعل ، ودرجة حرارة الانصهار (Tm) للبادئات.

مرحلة التهيئة:تتكون هذه المرحلة من تسخين التفاعل إلى درجة حرارة 94-96 درجة مئوية (أو 98 درجة مئوية إذا تم استخدام بوليمرات عالية الحرارة) ، والتي تتم لمدة 1-9 دقائق. هذه الخطوة مطلوبة فقط لبوليميرات الحمض النووي ، التي تتطلب التنشيط بالحرارة ، ما يسمى ببدء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الساخن.
مرحلة التمسخ:إنه أول حدث تدوير حراري منتظم ويتكون من تسخين التفاعل إلى 94-98 درجة مئوية لمدة 20-30 ثانية. يؤدي هذا إلى انقسام قالب الحمض النووي مع تدمير الروابط الهيدروجينية بين القواعد التكميلية وتشكيل جزيئات DNA أحادية السلسلة.
مرحلة التلدين:تنخفض درجة حرارة التفاعل إلى 50-65 درجة مئوية خلال 20-40 ثانية ، مما يسمح للبادئات بالارتباط بقالب الحمض النووي أحادي الجديلة. عادة ما تكون درجة حرارة التلدين حوالي 3-5 درجات مئوية تحت Tm من البادئات المستخدمة. تتشكل روابط الهيدروجين DNA-DNA المستقرة فقط عندما يتطابق التسلسل التمهيدي مع قالب التسلسل. يرتبط البوليميراز بالقالب الهجين التمهيدي ويبدأ في تخليق الحمض النووي.
مرحلة التمدد / الاستطالة:تعتمد درجة الحرارة في هذه المرحلة على بوليميراز الدنا المستخدم ؛ بوليميريز طق له درجة حرارة نشاطه المثلى عند 75-80 درجة مئوية ؛ عادة ما تستخدم درجة حرارة 72 درجة مئوية لهذا الإنزيم. في هذه المرحلة ، يقوم بوليميراز الدنا بتركيب خيط DNA جديد ، مكمل لخيط DNA الخاص بالقالب ، مضيفًا dNTPs المكملة للمصفوفة في اتجاه 5 "إلى 3" ، وربط المجموعة 5 "فوسفات من dNTPs بـ 3 مجموعة الهيدروكسيل في نهاية الحمض النووي (المتوسع) الناتج. يعتمد وقت التمدد على كل من بوليميريز الحمض النووي المستخدم وطول جزء الحمض النووي المراد تضخيمه. عادة ، عند درجة الحرارة المثلى ، تقوم بوليميراز الدنا ببلمرة ألف قاعدة في الدقيقة. في ظل الظروف المثلى ، أي في حالة عدم وجود قيود بسبب تقييد الركائز أو الكواشف ، في كل مرحلة من مراحل التوسع ، تتضاعف كمية الحمض النووي المستهدف ، مما يؤدي إلى تضخيم أسي (أسي) لجزء الحمض النووي.
الإطالة النهائية:هذه هي الخطوة الوحيدة ، التي يتم إجراؤها أحيانًا عند 70-74 درجة مئوية لمدة 5-15 دقيقة بعد آخر دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، من أجل ضمان تمديد أي DNA متبقي وحيد الخيط بالكامل.
الانتظار النهائي:يمكن استخدام هذه المرحلة عند درجة حرارة 4-15 درجة مئوية لفترة غير محددة من أجل الحفاظ على التفاعل على المدى القصير. للتحقق مما إذا كان تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) قد قام بتوليف جزء الحمض النووي المتوقع (يُطلق عليه أحيانًا "أمبليكون" أو "أمبليكون") ، يتم استخدام الرحلان الكهربي لهلام الاغاروز لفصل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل حسب الحجم. يتم تحديد حجم منتجات PCR من خلال المقارنة مع سلم DNA (محدد الوزن الجزيئي) ، الذي يحتوي على أجزاء DNA ذات حجم معروف ، يتم إجراؤه على مادة هلامية جنبًا إلى جنب مع منتجات PCR.

مراحل تفاعل البلمرة المتسلسل

يمكن تقسيم عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى ثلاث مراحل:

التضخيم الأسي: خلال كل دورة ، تتضاعف كمية المنتج (بافتراض كفاءة تفاعل بنسبة 100٪). رد الفعل حساس للغاية: هناك حاجة إلى كمية صغيرة فقط من الحمض النووي.
مرحلة التسوية: يتباطأ التفاعل لأن بوليميراز الحمض النووي يفقد النشاط ويؤدي استهلاك الكواشف مثل dNTPs والبادئات إلى تقييدها .
هضبة: لم يعد المنتج يتراكم بسبب استنفاد الكواشف والإنزيمات.

تحسين PCR

في الممارسة العملية ، قد لا يكون PCR ناجحًا وفقًا لـ أسباب مختلفة، لا سيما بسبب حساسيته للتلوث ، مما يؤدي إلى تضخيم المنتجات الثانوية للحمض النووي. في هذا الصدد ، تم تطوير عدد من التقنيات والإجراءات لتحسين ظروف PCR. يتم التعامل مع التلوث الأجنبي للحمض النووي من خلال بروتوكولات وإجراءات المختبرات التي تنقي الخلائط السابقة لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل من ملوثات الحمض النووي المحتملة. يتضمن هذا عادةً الفصل المكاني لمجموعات PCR من مناطق لتحليل أو تنقية منتجات PCR ، واستخدام الأواني البلاستيكية التي يمكن التخلص منها ، والتنظيف الشامل لسطح العمل بين خطوات التفاعل. تلعب تقنيات التصميم التمهيدي دورًا مهمًا في تحسين عزل منتجات PCR وفي تجنب تكوين المنتجات الثانوية ، ويمكن أن يساعد استخدام مكونات عازلة بديلة أو إنزيمات البوليميراز في تضخيم مناطق الحمض النووي الطويلة أو التي بها مشاكل. يمكن أن تؤدي إضافة الكواشف مثل فورماميد إلى أنظمة عازلة إلى زيادة خصوصية وإطلاق تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن إجراء محاكاة حاسوبية لنتائج PCR النظرية (PCR الإلكترونية) للمساعدة في تصميم البادئات.

تطبيق PCR

استخراج الحمض النووي الانتقائي

يسمح PCR بعزل شظايا الحمض النووي من الحمض النووي الجيني عن طريق التضخيم الانتقائي لمنطقة معينة من الحمض النووي. يكمل تطبيق PCR هذا العديد من التقنيات ، مثل إنشاء مجسات التهجين لتقنيات النشاف الجنوبية أو الشمالية واستنساخ الحمض النووي ، والتي تتطلب كميات كبيرة من الحمض النووي التي تمثل منطقة معينة من الحمض النووي. يزود تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هذه الطرق بمحتوى عالٍ من الحمض النووي النقي ، مما يسمح بتحليل عينات الحمض النووي ، حتى مع وجود كمية صغيرة من مادة البداية.

تتضمن التطبيقات الأخرى لـ PCR تسلسل الحمض النووي لتحديد تسلسل مضخم PCR غير معروف ، حيث يمكن استخدام أحد بادئات التضخيم في تسلسل Sanger ، وعزل تسلسل الحمض النووي لتسريع تقنيات الحمض النووي المؤتلف التي تتضمن إدخال تسلسل DNA في بلازميد أو مادة وراثية من أخرى الكائن الحي. يمكن فحص مستعمرات البكتيريا (E. coli) بسرعة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتصحيح بنية ناقل الحمض النووي. يمكن أيضًا استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في أخذ البصمات الوراثية ؛ تقنية مستخدمة في الطب الشرعي لتحديد هوية شخص أو كائن حي من خلال مقارنة الحمض النووي التجريبي باستخدام طرق PCR المختلفة.

بعض تقنيات بصمات الأصابع تمييزية للغاية ويمكن استخدامها لتحديد العلاقات الجينية بين الناس ، مثل الوالدين والطفل أو الأشقاء ، وتستخدم في اختبار الأبوة. يمكن أيضًا استخدام هذه التقنية لتحديد العلاقات التطورية بين الكائنات الحية.

تضخيم وتقدير الحمض النووي

نظرًا لأن تفاعل البوليميراز المتسلسل يزيد عدد نسخ مناطق الحمض النووي المستهدفة ، يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحليل كميات صغيرة جدًا من العينة. غالبًا ما يكون هذا أمرًا بالغ الأهمية في علم الطب الشرعي عندما تتوفر فقط كميات ضئيلة من الحمض النووي كدليل. يمكن أيضًا استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحليل الحمض النووي القديم الذي يبلغ عمره عشرات الآلاف من السنين. تم استخدام تقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل هذه بنجاح على حيوانات مثل الماموث البالغ من العمر أربعين ألف عام ، وكذلك على الحمض النووي البشري ، في تطبيقات تتراوح من تحليل المومياوات المصرية إلى التعرف على القيصر الروسي.

تقيس طرق PCR الكمية مقدار تسلسل معين موجود في عينة - غالبًا ما تستخدم الطريقة لتحديد مستوى التعبير الجيني. إن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي هو أداة تحليل كمية الحمض النووي التي تقيس تراكم الحمض النووي للمنتج بعد كل دورة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل.

PCR في تشخيص الأمراض

يسمح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بالتشخيص المبكر للأمراض الخبيثة مثل اللوكيميا والأورام اللمفاوية ، والتي أصبحت الآن عالية التطور في أبحاث السرطان وتستخدم بالفعل بشكل روتيني. يمكن إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل مباشرة على عينات الحمض النووي الجينومي لاكتشاف الخلايا الخبيثة الخاصة بالانتقال مع حساسية أعلى بـ 10000 مرة على الأقل من الطرق الأخرى.

يسمح تفاعل البوليميراز المتسلسل أيضًا باكتشاف الكائنات الدقيقة غير المزروعة أو بطيئة النمو مثل المتفطرات والبكتيريا اللاهوائية والفيروسات من زراعة الأنسجة والنماذج الحيوانية. أساس تطبيقات تشخيص تفاعل البوليميراز المتسلسل في مجال علم الأحياء الدقيقة هو تحديد العوامل المعدية والتمايز بين السلالات غير المسببة للأمراض من السلالات المسببة للأمراض بسبب جينات معينة.

يمكن أيضًا اكتشاف الحمض النووي الفيروسي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل. يجب أن تكون المواد الأولية محددة لتسلسل الحمض النووي المستهدف للفيروس ، ويمكن استخدام PCR لتحليل الحمض النووي التشخيصي أو تسلسل الجينوم الفيروسي. تسمح الحساسية العالية لـ PCR باكتشاف الفيروسات بعد فترة وجيزة من الإصابة وحتى قبل ظهور المرض. هذا الاكتشاف المبكر للفيروس يمكن أن يمنح الأطباء خيارات علاجية كبيرة. يمكن أيضًا تحديد كمية الفيروس ("الحمل الفيروسي") في المريض الطريقة الكميةتحليل الحمض النووي على أساس PCR.

الاختلافات في طرق تفاعل البلمرة المتسلسل الأساسية

PCR الخاص بأليل: طريقة تشخيصية أو استنساخ تعتمد على تعدد أشكال النوكليوتيدات الفردية (SNPs) (الاختلافات في قاعدة واحدة في الحمض النووي). يتطلب معرفة مسبقة بتسلسل الحمض النووي ، بما في ذلك الاختلافات بين الأليلات ، ويستخدم البادئات التي تمتد نهاياتها الثلاثة على SNP. يكون تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الصارم أقل فاعلية في وجود عدم تطابق قالب التمهيدي ، وبالتالي تضخيم ناجح باستخدام إشارات أولية خاصة بـ SNP وجود SNPs محددة في التسلسل.
تجميع PCR أو تجميع دورة البلمرة (PCR):التوليف الاصطناعي لتسلسل الحمض النووي الطويل PCRعلى احتياطي قليل النوكليوتيدات الطويلة ذات المقاطع القصيرة المتداخلة. يتناوب قليل النوكليوتيدات بين اتجاهات حبلا الإحساس ومضاد المعنى ، وتحدد الأجزاء المتداخلة ترتيب شظايا PCR ، وبالتالي تنتج بشكل انتقائي منتج DNA الطويل النهائي.
PCR غير متماثل: يضخم في الغالب خيطًا واحدًا من الحمض النووي في قالب DNA مزدوج الشريطة. تستخدم في تحقيق التسلسل والتهجين حيث يلزم تضخيم واحد فقط من السلاسل التكميلية. يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل كالمعتاد ، ولكن مع وجود فائض كبير من البادئات لتضخيم الشريط. نظرًا للتضخيم البطيء (التقدم الحسابي) في نهاية التفاعل بعد استخدام التمهيدي المحدد ، يلزم إجراء دورات PCR إضافية. يستخدم التعديل النهائي لهذه العملية المعروفة باسم "LATE-PCR" (الخطي بعد المرحلة الأسية - PCR) أساسًا محددًا بدرجة حرارة انصهار أعلى (Tm) من التمهيدي الزائد للحفاظ على كفاءة التفاعل حيث ينخفض تركيز التمهيدي المحدد في منتصف الطريق ردة الفعل.
الطلب الهاتفي PCR: طريقة متوازية للغاية بهدف الحصول على جزيئات DNA دقيقة لتخليق الجينات. يتم تعديل المجموعة المعقدة من جزيئات الحمض النووي بواسطة ملصقات مرافقة فريدة قبل التسلسل المتوازي الضخم. ثم توفر البادئات الموجهة بالعلامات جزيئات استهداف التسلسل بواسطة PCR.
التضخيم المعتمد على هيليكاز:يشبه PCR التقليدي ولكنه يتطلب درجة حرارة ثابتة مقارنة بالدوران من خلال دورات تمسخ وتحمية / تمدد. يتم استخدام إنزيم DNA Helicase ، وهو إنزيم يعمل على فك الحمض النووي ، بدلاً من التمسخ الحراري.
بدء التشغيل السريع PCR: تقنية تقلل التضخيم غير المحدد أثناء الإعداد الأولي لخطوات تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن إجراؤها يدويًا عن طريق تسخين مكونات التفاعل إلى درجة حرارة تمسخ (على سبيل المثال 95 درجة مئوية) قبل إضافة البوليميراز. تم تطوير أنظمة من الإنزيمات المتخصصة التي تمنع نشاط البوليميراز في درجة حرارة الغرفة ، إما عن طريق ربط الأجسام المضادة أو في وجود مثبطات مرتبطة تساهميًا ، والتي لا تنفصل إلا بعد خطوة التنشيط ذات درجة الحرارة العالية. يتم الوصول إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على الساخن / البارد باستخدام بوليميرات هجينة جديدة غير نشطة في درجات الحرارة المحيطة ويتم تنشيطها على الفور في درجات حرارة الاستطالة.
تسلسل الأقمار الصناعية البيني PCR (ISSR): PCR هي تقنية لبصمة الحمض النووي التي تزيد من عدد نسخ المناطق بين تسلسلات التكرار البسيطة للحصول على بصمة فريدة من طول الجزء المضخم.
معكوسة PCRتستخدم على نطاق واسع لتحديد مناطق التسلسل حول عمليات الإدخال الجينومي. إنها تنطوي على سلسلة من انشقاقات الحمض النووي والربط الذاتي ، مما يؤدي إلى تسلسلات معروفة في أي من طرفي التسلسل غير المعروف.
PCR بوساطة الربط:يستخدم روابط DNA صغيرة مرتبطة بالحمض النووي ذي الأهمية والعديد من البادئات المرتبطة بوصلات الحمض النووي ؛ تستخدم لتسلسل الحمض النووي ، والمشي الجينومي ، وبصمة الحمض النووي.
PCR الخاصة بالميثيلة(MSP): تم تطويره بواسطة ستيفن بالين وجيم هيرمان في كلية الطب بجامعة جونز هوبكنز ، ويستخدم للكشف عن مثيلة جزر CpG في الحمض النووي الجيني. تتم معالجة الحمض النووي أولاً باستخدام ثنائي كبريتيت الصوديوم ، والذي يحول قواعد السيتوزين غير الميثيل إلى اليوراسيل ، والذي يُعرف باسم الثايمين بواسطة بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). ثم يتم إجراء اثنين من PCRs على الحمض النووي المعدل باستخدام مجموعات من البادئات المتطابقة ، باستثناء أي جزيرة CpG ضمن تسلسل التمهيدي. في هذه النقاط ، تتعرف مجموعة واحدة من البادئات على الحمض النووي مع السيتوزينات لزيادة عدد نسخ الحمض النووي الميثلي ، ومجموعة واحدة تتعرف على الحمض النووي مع اليوراسيل أو الثايمين لتضخيم الحمض النووي غير الميثيل. يمكن أيضًا إجراء MSP باستخدام qPCR للحصول على معلومات كمية بدلاً من المعلومات النوعية عن المثيلة.
التمهيدي الصغير - PCR:يتم استخدام البوليميرات المقاومة للحرارة (S-Tbr) ، والتي يمكن أن تتمدد من بادئات قصيرة ("smalligos") ، بعدد 9 أو 10 نيوكليوتيدات. تسمح هذه الطريقة لـ PCR باستهداف المناطق المرتبطة ببادئات أصغر وتستخدم لتضخيم تسلسل الحمض النووي المحفوظ مثل جين 16S rRNA (أو 18S حقيقية النواة).
يعتمد تضخيم المسبار على الربط المتعدد (MLPA): يسمح بتضخيم أهداف متعددة باستخدام زوج تمهيدي واحد فقط ، وبالتالي تجنب قيود دقة تعدد إرسال PCR.
Multiplex PCRيتكون من عدة مجموعات من البادئات في خليط PCR واحد من أجل الحصول على أمبليكونات بأحجام مختلفة خاصة بتسلسلات DNA المختلفة. من خلال استهداف عدة جينات في نفس الوقت ، من الممكن الحصول على معلومات إضافية عند إجراء اختبار واحد ، الأمر الذي قد يتطلب عدة مرات أكثر من الكواشف والمزيد من الوقت لأداءه. يجب تحسين درجات حرارة التلدين لكل مجموعة أساس لكي تعمل بشكل صحيح ضمن تفاعل واحد وبأحجام أمبليكون. أي أن طول زوج قاعدتهم يجب أن يكون مختلفًا بشكل كافٍ لتشكيل نطاقات مميزة عند التصوير بالهلام الكهربائي.
متداخلة PCR: يزيد من خصوصية تضخيم الحمض النووي عن طريق تقليل الخلفية بسبب تضخيم الحمض النووي غير النوعي. يتم استخدام مجموعتين من البادئات في تقريرين متتاليين من تفاعل البوليميراز المتسلسل. في التفاعل الأول ، يتم استخدام زوج واحد من البادئات لتصنيع منتجات DNA والتي ، بالإضافة إلى هدفها المقصود ، قد لا تزال تتكون من شظايا DNA غير مكبرة بشكل محدد. تُستخدم المنتجات بعد ذلك في PCR ثانٍ مع مجموعة من البادئات التي تختلف مواقع الربط الخاصة بها كليًا أو جزئيًا عن الأطراف الثلاثة لكل من البادئات المستخدمة في التفاعل الأول. غالبًا ما يكون تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل أكثر نجاحًا في تضخيم شظايا الحمض النووي الطويلة بشكل خاص من تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي ، ولكنه يتطلب معرفة أكثر تفصيلاً بالتسلسلات المستهدفة.
تمديد متداخلة PCRأو تداخل تمديد الربط(SOE): تقنية هندسة وراثية تُستخدم لربط قطعتين أو أكثر من الحمض النووي التي تحتوي على متواليات تكميلية. تُستخدم لربط قطع من الحمض النووي تحتوي على جينات أو تسلسلات تحكم أو طفرات ؛ تسمح هذه التقنية بإنشاء تركيبات DNA محددة وطويلة.
PCR الكمي (qPCR):تستخدم لقياس كمية منتج PCR (عادة في الوقت الحقيقي). يحدد الكميات الأولية من DNA أو cDNA أو RNA. يستخدم QPCR على نطاق واسع لتحديد وجود تسلسل DNA في عينة ، وعدد النسخ في العينة. يتميز PCR في الوقت الحقيقي الكمي بدرجة عالية جدًا من الدقة. تستخدم طرق QRT-PCR (أو QF-PCR) الأصباغ الفلورية مثل Sybr Green أو EvaGreen أو مجسات DNA المحتوية على الفلوروفور مثل TaqMan لقياس كمية المنتج المضخم في الوقت الفعلي. يشار إليها أحيانًا باسم RT-PCR (Real Time PCR) أو RQ-PCR. QRT-PCR أو RTQ-PCR هي اختصارات أكثر ملاءمة حيث يشير RT-PCR عادةً إلى النسخ العكسي PCR ، وغالبًا ما يستخدم مع qPCR.
النسخ العكسي PCR (RT-PCR):لزيادة عدد نسخ الحمض النووي من الحمض النووي الريبي. يقوم النسخ العكسي بنسخ الحمض النووي الريبي إلى (كدنا) ، والذي يتم تضخيمه بعد ذلك بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. يستخدم RT-PCR على نطاق واسع في التنميط التعبيري لاكتشاف التعبير الجيني أو لتحديد تسلسل نسخة RNA ، بما في ذلك مواقع بدء النسخ وإيقافه. إذا كان تسلسل الحمض النووي الجيني للجين معروفًا ، فيمكن استخدام RT-PCR لرسم خريطة لموقع exons و introns في الجين. عادةً ما يتم تحديد نهاية الجين 5 بوصات (المقابلة لموقع بدء النسخ) بواسطة RACE-PCR (التضخيم السريع لنهايات CDNA).
المرحلة الصلبة PCR: يغطي عدة معانٍ ، بما في ذلك "تضخيم البولونيوم" (حيث يتم إنتاج مستعمرات تفاعل البوليميراز المتسلسل على مصفوفة هلامية ، على سبيل المثال) ، و "جسر تفاعل البوليميراز المتسلسل" (البادئات مرتبطة تساهميًا بسطح دعم صلب) ، المرحلة الصلبة التقليدية PCR (حيث "تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المتماثل "يستخدم في وجود مواد أولية تحمل دعامة صلبة مع تسلسل يتوافق مع أحد البادئات المائية) ، و PCR ذو المرحلة الصلبة المحسّنة (حيث يمكن تحسين الطور الصلب التقليدي PCR من خلال استخدام مواد أولية متداخلة عالية Tm مع دعم قوي مع خيار تطبيق "خطوة" حرارية لتعزيز تكوين البادئات بدعامة صلبة).
PCR بالتناوب الحراري غير المتماثل (TAIL-PCR):يستخدم لعزل تسلسل غير معروف بعد تسلسل معروف. في تسلسل معروف ، يستخدم TAIL-PCR زوجًا تمهيديًا متداخلًا مع درجات حرارة تلدين مختلفة ؛ يستخدم التمهيدي المنحل للتضخيم في اتجاه مختلف عن التسلسل غير المعروف.
Touchdown PCR (الخطوة PCR):يهدف متغير PCR إلى تقليل الخلفية غير المحددة عن طريق خفض درجة حرارة التلدين تدريجيًا مع تقدم دورات PCR. عادة ما تكون درجة حرارة التلدين في الدورات الأولية عدة درجات (3-5 درجات مئوية) أعلى من Tm من البادئات المستخدمة ، بينما في الدورات اللاحقة ، تكون درجة الحرارة عدة درجات (3-5 درجات مئوية) أقل من Tm من الاشعال. تعطي درجات الحرارة المرتفعة خصوصية أكبر للربط التمهيدي ، وتعزز درجات الحرارة المنخفضة تضخيمًا أكثر كفاءة من منتجات معينة تم إنشاؤها أثناء الدورات الأولية.
PAN-AC: يستخدم ظروف متساوية الحرارة للتضخيم ويمكن تطبيقها على الخلايا الحية.
المشي السريع العالمي من خلال الجينوم: للمشي في الجينوم والبصمات الجينية باستخدام PCR "ثنائي الاتجاه" أكثر تحديدًا من الأساليب التقليدية "أحادية الاتجاه" (باستخدام أساس تمهيدي واحد خاص بالجينات وبادئ واحد مشترك - والذي يمكن أن يؤدي إلى "ضوضاء" أثرية) بسبب آلية ، بما في ذلك تشكيل هيكل لاسو. مشتقات UFW المبسطة هي "Lane RAGE" (PCR المتداخل المعتمد على lasso للتضخيم السريع لنهايات DNA الجينومية) ، "5" RACE Lane و "3" RACE Lane ".
فيسيليكوPCRيشير (PCR الرقمي ، PCR الظاهري ، PCR الإلكتروني ، e-PCR) إلى أدوات الحوسبة المستخدمة لحساب نتائج تفاعل البوليميراز النظري باستخدام مجموعة معينة من البادئات (تحقيقات) لتضخيم تسلسل الحمض النووي من الجينوم المتسلسل أو النسخ.

تاريخ PCR

في مقال نُشر في مجلة علم الأحياء الجزيئي عام 1971 ، وصف كليبي وزملاؤه لأول مرة طريقة اختبار إنزيمية لتكرار نموذج قصير للحمض النووي باستخدام مواد أولية في أنبوب اختبار. ومع ذلك ، فإن هذا المظهر المبكر للمبدأ الأساسي لـ PCR لم يحظ باهتمام كبير ، وعادة ما يُنسب اختراع تفاعل البوليميراز المتسلسل في 1983 إلى Cary Mullis.

عندما طور Mullis PCR في عام 1983 ، كان يعمل في Emeryville ، كاليفورنيا لصالح Cetus Corporation ، وهي واحدة من أوائل شركات التكنولوجيا الحيوية. هناك كان مسؤولاً عن تخليق خيوط الحمض النووي القصيرة. كتب موليس أنه تصور PCR أثناء القيادة على طول الطريق السريع ساحل المحيط الهادئ ليلة واحدة في سيارته. كان يلعب في ذهنه طريقة جديدة لتحليل التغييرات (الطفرات) في الحمض النووي عندما أدرك أنه اخترع طريقة لزيادة عدد نسخ أي قطعة من الحمض النووي من خلال الدورات المتكررة للنسخ بوساطة بوليميريز الحمض النووي. في مجلة Scientific American ، لخص موليس الإجراء: "بدءًا من جزيء واحد من المادة الوراثية للحمض النووي ، يمكن لـ PCR توليد 100 مليار من هذه الجزيئات في يوم واحد. رد الفعل هذا سهل التحقيق. لا يتطلب أكثر من أنبوب اختبار ، وعدد قليل من الكواشف البسيطة ، ومصدر حرارة. " حصل على جائزة نوبل في الكيمياء عام 1993 عن اختراعه ، بعد سبع سنوات من وضعه هو وزملاؤه في Cetus لأول مرة اقتراحه موضع التنفيذ. ومع ذلك ، بقي بعض الجدل حول المساهمات الفكرية والعملية لعلماء آخرين في عمل موليس ، وما إذا كان هو المخترع الوحيد لمبدأ تفاعل البوليميراز المتسلسل.

تعتمد طريقة PCR على استخدام بوليميريز DNA مناسب قادر على تحمل درجات الحرارة العالية> 90 درجة مئوية (194 درجة فهرنهايت) المطلوبة لشق خيطي DNA في الحلزون المزدوج للحمض النووي بعد كل دورة تكرار. إن بوليميرات الدنا ، التي استخدمت في الأصل للتجارب في المختبر ، تنذر بتفاعل البوليميراز المتسلسل ، لم تكن قادرة على تحمل درجات الحرارة المرتفعة هذه. لذلك ، كانت إجراءات تكرار الحمض النووي المبكرة غير فعالة للغاية وتستغرق وقتًا طويلاً ، كما تطلبت كميات كبيرة من بوليميريز الحمض النووي والمعالجة المستمرة طوال العملية بأكملها.

اكتشاف في عام 1976 طاق بوليميراز - بوليميراز الحمض النووي المعزول من البكتيريا المحبة للحرارة ، ترمسأكواتيكوس- التي تعيش بشكل طبيعي في بيئات حارة (من 50 إلى 80 درجة مئوية (122 إلى 176 درجة فهرنهايت)) مثل الينابيع الساخنة - مهدت الطريق لتحسينات كبيرة في تفاعل البوليميراز المتسلسل. بوليميريز الحمض النووي المعزول من ت.أكواتيكوس، مستقر في درجات حرارة عالية ويظل نشطًا حتى بعد تمسخ الحمض النووي ، وبالتالي يلغي الحاجة إلى إضافة بوليميرات DNA جديدة بعد كل دورة. هذا جعل من الممكن أتمتة عملية تضخيم الحمض النووي على أساس مدور حراري حراري.

حروب براءات الاختراع

تم تسجيل براءة اختراع طريقة PCR المقترحة من قبل Carey Mullis وتم تعيينها لشركة Cetus حيث كان Mullis يعمل عندما اخترع التقنية في عام 1983. كما تم تسجيل براءة اختراع إنزيم Taq polymerase. كانت هناك عدة دعاوى قضائية رفيعة المستوى تتعلق بالمنهجية ، بما في ذلك دعوى قضائية غير ناجحة رفعتها شركة DuPont. حصلت شركة الأدوية Hoffmann-La Roche على حقوق براءات الاختراع في عام 1992 وتحتفظ حاليًا بتلك الحقوق التي لا تزال محمية.

لا تزال معركة براءة اختراع مماثلة لإنزيم Taq polymerase مستمرة في بعض الولايات القضائية حول العالم بين Roche و Promega. تجاوزت الحجج القانونية براءات الاختراع الأصلية PCR و Taq polymerase ، التي انتهت صلاحيتها في 28 مارس 2005.

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)- طريقة تجريبية للبيولوجيا الجزيئية ، وهي تضخيم محدد للأحماض النووية المستحثة بواسطة بادئات قليلة النوكليوتيد الاصطناعية في المختبر.

تعود فكرة تطوير طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى الباحث الأمريكي كاري موليس ، الذي ابتكر في عام 1983 طريقة جعلت من الممكن تضخيم الحمض النووي في سياق الازدواج الدوري باستخدام إنزيم بوليميريز الحمض النووي في المختبر. بعد سنوات قليلة من نشر هذه الفكرة ، في عام 1993 ، حصل K.Mullis على جائزة نوبل عن ذلك.

في بداية استخدام الطريقة ، بعد كل دورة تبريد وتسخين ، كان من الضروري إضافة بوليميريز DNA إلى خليط التفاعل ، حيث تم تعطيله بسرعة عند درجة حرارة عالية. كان الإجراء غير فعال للغاية ، ويتطلب الكثير من الوقت والإنزيم. في عام 1986 ، تم تعديله بشكل كبير باستخدام بوليميراز الحمض النووي من البكتيريا المحبة للحرارة. هذه الإنزيمات قادرة على تحمل دورات تفاعل متعددة ، مما يجعل من الممكن أتمتة تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم عزل واحدة من أكثر أنواع بوليمرات الحمض النووي المقاومة للحرارة شيوعًا من البكتيريا الترمس المائيواسمه طق-بوليميراز الحمض النووي.

جوهر الطريقة.تعتمد الطريقة على النسخ الانتقائي المتعدد لمنطقة معينة من DNA باستخدام إنزيم Taq-DNA polymerase. يتيح تفاعل البوليميراز المتسلسل الحصول على تضخمات تصل إلى عدة آلاف من أزواج القواعد في الطول. لزيادة طول منتج PCR إلى 20-40 ألف زوج قاعدي ، يتم استخدام مزيج من البوليمرات المختلفة ، ولكن هذا لا يزال أقل بكثير من طول الحمض النووي الصبغي لخلية حقيقية النواة.

يتم إجراء التفاعل في منظم حرارة قابل للبرمجة (مكبر للصوت) - وهو جهاز يمكنه التصرف بسرعة كافية

تبريد وتسخين أنابيب الاختبار (عادةً بدقة لا تقل عن 0.1 درجة مئوية). تسمح لك مكبرات الصوت بتعيين البرامج المعقدة ، بما في ذلك تلك التي تحتوي على إمكانية "البدء السريع" والتخزين اللاحق. بالنسبة إلى PCR في الوقت الفعلي ، يتم إنتاج أجهزة مزودة بكاشف التألق. هناك أيضًا أدوات مزودة بغطاء أوتوماتيكي وحجرة صفيحة دقيقة للاندماج في الأنظمة الآلية.

عادة ، عند تنفيذ PCR ، يتم تنفيذ 20-45 دورة ، كل منها تتكون من ثلاث مراحل: تمسخ ، التلدين التمهيدي ، الاستطالة (الشكل 6.1 و 6.2). في التين. يوضح 6.1 ديناميكيات تغير درجة الحرارة في أنبوب الاختبار أثناء دورة PCR.

أرز. 6.1رسم بياني لتغيرات درجة الحرارة في أنبوب اختبار خلال دورة واحدة من تفاعل البلمرة المتسلسل

تمسخ لمصفوفة الحمض النووييتم إجراؤها عن طريق تسخين خليط التفاعل إلى 94-96 درجة مئوية لمدة 5-90 ثانية ، بحيث يتم فصل خيوط الحمض النووي. وتجدر الإشارة إلى أنه قبل الدورة الأولى ، يتم تسخين خليط التفاعل مسبقًا لمدة 2-5 دقائق لإفساد المصفوفة الأصلية تمامًا ، مما يجعل من الممكن تقليل كمية نواتج التفاعل غير المحددة.

أرز. 6.2مخطط الدورة الأولى لتفاعل البلمرة المتسلسل

مرحلة التلدين التمهيدي.مع انخفاض تدريجي في درجة الحرارة ، ترتبط المواد الأولية بشكل مكمل بالقالب. تعتمد درجة حرارة التلدين على تركيبة البادئات وتكون عادة أقل بـ4-5 درجات من درجة حرارة الانصهار المحسوبة. مدة المرحلة 5-60 ثانية.

خلال المرحلة التالية - استطالة- هناك توليفة من خيط DNA الابنة على مصفوفة الأم. تعتمد درجة حرارة الاستطالة على البوليميراز. تكون بوليمرات الحمض النووي المستخدمة بشكل متكرر Taq و Pfu أكثر نشاطًا عند 72 درجة مئوية. عادة ما يكون وقت الاستطالة ، الذي يعتمد بشكل أساسي على طول منتج PCR ، 1 دقيقة لكل 1000 زوج أساسي.

الوكالة الاتحادية للتعليم

مؤسسة تعليمية حكومية

التعليم المهني العالي

"أكاديمية كاريليان الحكومية التربوية"

عمل الدورة على الموضوع:

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) وتطبيقاته

أنجزته: الطالبة كورياجينا فاليريا أليكساندروفنا

فحص بواسطة: كاربيكوفا ناتاليا ميخائيلوفنا

بتروزافودسك 2013

مقدمة

الفصل 1. المراجعة الأدبية

1.5.4 تأثير "الهضبة"

1.5.6 التضخيم

استنتاج

مقدمة

تميزت السنوات العشرين الماضية بالإدخال الواسع النطاق للطرق الوراثية الجزيئية في العلوم البيولوجية والطبية والزراعية.

بحلول أوائل السبعينيات ، بدا أن البيولوجيا الجزيئية قد وصلت إلى مرحلة معينة من الاكتمال. خلال هذه الفترة ، كان الهدف الرئيسي للبحث الوراثي الجزيئي هو الكائنات الحية الدقيقة. طرح الانتقال إلى حقيقيات النوى مشاكل جديدة تمامًا للباحثين لا يمكن حلها باستخدام طرق التحليل الجيني التي كانت موجودة في ذلك الوقت. أصبح الاختراق في تطوير علم الوراثة الجزيئي ممكنًا بفضل ظهور أداة تجريبية جديدة - نوكليازات تقييدية. في السنوات اللاحقة ، بدأ عدد طرق تحليل الحمض النووي المباشرة القائمة على مناهج مختلفة نوعيًا في الزيادة بسرعة.

جعلت التقنيات الحديثة في كثير من الحالات من الممكن البدء في دراسة التنظيم الهيكلي والوظيفي الدقيق للجينومات النووية وغير النووية لكائنات مختلفة على مستوى أعمق. كان لهذا أهمية خاصة لتطوير طرق جديدة للتشخيص والعلاج. امراض عديدة... كان على نفس القدر من الأهمية إمكانية استخدام إنجازات علم الوراثة الجزيئي في علم الأحياء السكانية وفي التربية لتحديد وتحليل التباين الجيني للمجموعات والأصناف والسلالات ، وتحديد الأفراد ذوي القيمة الاقتصادية واعتمادهم ، وإنشاء كائنات معدلة وراثيًا ، ولحل القضايا الأخرى.

كل أسلوب له مزاياه وعيوبه. لا طريقة عالمية، والتي يمكن أن تحل جميع المشاكل التي تنشأ. لذلك ، يعد اختيار طريقة معينة للبحث الجاري من أهم مراحل أي عمل علمي.

الفصل 1. المراجعة الأدبية

1.1 تاريخ اكتشاف تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

في عام 1983 ، ك. موليس وآخرون. نشر وحصل على براءة اختراع طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، والتي كان من المقرر أن يكون لها تأثير عميق على جميع مجالات البحث والتطبيقات الخاصة بالأحماض النووية. تبين أن أهمية هذه الطريقة في علم الأحياء الجزيئي وعلم الوراثة كبيرة جدًا وواضحة لدرجة أنه بعد سبع سنوات حصل المؤلف على جائزة نوبل في الكيمياء.

في بداية استخدام الطريقة ، بعد كل دورة تبريد وتسخين ، كان من الضروري إضافة بوليميريز DNA إلى خليط التفاعل ، حيث تم تعطيله عند درجة حرارة عالية مطلوبة لفصل خيوط حلزون DNA. كان إجراء التفاعل غير فعال نسبيًا ، ويتطلب الكثير من الوقت والإنزيم. في عام 1986 ، تم تحسين طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل ملحوظ. تم اقتراح استخدام بوليميرات الحمض النووي من البكتيريا المحبة للحرارة. أثبتت هذه الإنزيمات أنها مستقرة حرارياً وكانت قادرة على تحمل دورات تفاعل متعددة. جعل استخدامها من الممكن تبسيط وأتمتة PCR. تم عزل واحدة من أولى بلمرات الحمض النووي المقاومة للحرارة من البكتيريا الترمس المائيواسمه طق- بوليميراز.

إمكانية تضخيم أي مقطع DNA معروف تسلسل النيوكليوتيدات والحصول عليه بعد اكتمال PCR بشكل متجانس والكمية التحضيرية يتم بواسطة PCR طريقة بديلةالاستنساخ الجزيئي لشظايا الحمض النووي القصيرة. في الوقت نفسه ، ليست هناك حاجة لاستخدام تقنيات منهجية معقدة تستخدم في الهندسة الوراثية في الاستنساخ التقليدي. لقد أدى تطوير طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) إلى توسيع القدرات المنهجية لعلم الوراثة الجزيئي ، ولا سيما الهندسة الوراثية ، إلى حد كبير لدرجة أنها غيرت بشكل جذري وعززت الإمكانات العلمية للعديد من مجالاتها.

1.2 أنواع مختلفة من تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

· متداخلة PCR- تستخدم لتقليل عدد المنتجات الثانوية للتفاعل. يتم استخدام زوجين من البادئات ويتم إجراء تفاعلين متتاليين. يقوم زوج ثان من البادئات بتضخيم امتداد الحمض النووي داخل ناتج التفاعل الأول.

· PCR المقلوب- يستخدم في حالة معرفة مساحة صغيرة فقط ضمن التسلسل المطلوب. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص عندما يكون من الضروري تحديد التسلسلات المجاورة بعد إدخال الحمض النووي في الجينوم. لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل المقلوب ، يتم إجراء سلسلة من قطع الحمض النووي باستخدام نوكليازات مقيدة<#"justify">تفاعل البلمرة المتسلسل التمهيدي

· PCR الخاص بالمجموعة- PCR للأقارب<#"center">1.3 تفاعل البلمرة المتسلسل

تم اكتشاف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، الذي تم اكتشافه في منتصف الثمانينيات ، وهو قادر على زيادة عدد نسخ العينة الأصلية بملايين المرات على مدى عدة ساعات. خلال كل دورة تفاعل ، يتم تكوين نسختين من الجزيء الأصلي. يمكن أن تعمل كل نسخة من نسخ الحمض النووي المركبة كقالب لتركيب نسخ DNA جديدة في الدورة التالية. وبالتالي ، يؤدي التكرار المتعدد للدورات إلى زيادة عدد النسخ أضعافًا مضاعفة. ويترتب على الحسابات أنه حتى مع 30 دورة ، فإن عدد نسخ الجزيء الأصلي سيكون أكثر من مليار. حتى لو أخذنا في الاعتبار أنه لا يتم تكرار جميع الأمبليونات أثناء كل دورة ، فإن العدد الإجمالي للنسخ ، على الرغم من ذلك ، يعد رقمًا كبيرًا إلى حد ما.

تتكون كل دورة من تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) من الخطوات التالية:

· تمسخ - تؤدي الزيادة في درجة الحرارة إلى فك وانقسام جزيء DNA مزدوج الشريطة إلى جزئين أحادي الشريطة ؛

· التلدين - يسمح خفض درجة الحرارة للطلاء الأولي بالالتصاق بالمناطق التكميلية لجزيء الحمض النووي ؛

· الاستطالة - يكمل إنزيم بوليميراز DNA الخيط التكميلي.

لتضخيم الجزء المحدد ، يتم استخدام اثنين من بادئات قليل النوكليوتيد (بادئات) ، تحيط بمنطقة DNA معينة. التمهيدي الموجهة 3 - ينتهي تجاه بعضهما البعض وباتجاه التسلسل الذي يحتاج إلى تضخيم. ينفذ بوليميراز الدنا تخليق (تمديد) خيوط دنا مكملة لبعضها البعض ، بدءًا من البادئات. أثناء تخليق الحمض النووي ، يتم دمج البادئات فعليًا في سلسلة جزيئات الحمض النووي المركبة حديثًا. يمكن أن يعمل كل خيط من جزيء DNA يتكون من أحد البادئات كقالب لتركيب خيط DNA مكمل باستخدام مادة أولية أخرى.

1.4 إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في أنابيب بولي بروبيلين رقيقة الجدران خاصة ، متوافقة في الحجم مع جهاز التدوير الحراري المستخدم (مكبر الصوت) - جهاز يتحكم في درجة الحرارة وخصائص الوقت لمراحل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

1.5 مبدأ طريقة تفاعل البلمرة المتسلسل

تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو طريقة تضخيم الحمض النووي في المختبر ، والتي يمكن من خلالها ، في غضون ساعات قليلة ، عزل تسلسل DNA محدد ومضاعفته بلايين المرات. إن إمكانية الحصول على عدد كبير من نسخ منطقة محددة بدقة من الجينوم يبسط إلى حد كبير دراسة عينة الحمض النووي المتاحة.

لإجراء تفاعل البلمرة المتسلسل ، يجب استيفاء عدد من الشروط:

1.5.1 وجود عدد من المكونات في خليط التفاعل

المكونات الرئيسية لخليط التفاعل (PCR) هي: Tris-HCl ، KCl ، MgCl 2، خليط من ثلاثي فوسفات النوكليوتيدات (ATP ، GTP ، CTP ، TTF) ، مواد أولية (oligonucleotides) ، تحضير الحمض النووي المحلل ، بوليميراز DNA القابل للحرارة. يشارك كل مكون من مكونات خليط التفاعل بشكل مباشر في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) ، ويؤثر تركيز الكواشف بشكل مباشر على مسار التضخيم.

· Tris-HCl - يحدد الرقم الهيدروجيني لخليط التفاعل ، ويخلق سعة عازلة. يعتمد نشاط بوليميريز DNA على الرقم الهيدروجيني للوسط ، وبالتالي فإن قيمة الأس الهيدروجيني تؤثر بشكل مباشر على مسار تفاعل البوليميراز المتسلسل. عادةً ما يكون الرقم الهيدروجيني بين 8 و 9.5. يتم أخذ قيمة عالية للأس الهيدروجيني نظرًا لحقيقة أنه مع ارتفاع درجة الحرارة ، ينخفض الرقم الهيدروجيني لمخزن Tril-HCl المؤقت.

· KCl - يؤثر تركيز كلوريد البوتاسيوم حتى 50 ملي مولار على مسار عمليات التمسخ والتلدين ، والتركيز الذي يزيد عن 50 ملي مولار يمنع بوليميريز الحمض النووي.

· مغكل 2- بما أن بوليميريز DNA هو Mg 2+- إنزيم معتمد ، يؤثر تركيز أيونات المغنيسيوم على نشاط الإنزيم (Mg 2+معقدات الأشكال مع NTF - هذه المجمعات هي الركيزة للبوليميراز). يؤدي التركيز العالي إلى زيادة التضخيم غير المحدد ، ويؤدي التركيز المنخفض إلى تثبيط التفاعل ، ويكون الحد الأمثل (لمختلف البوليمرات) في حدود 0.5 - 5 ملي مولار. بالإضافة إلى ذلك ، يؤثر تركيز أملاح المغنيسيوم على مسار عمليات التمسخ والتلدين - زيادة في تركيز المغنيسيوم. 2+يسبب زيادة في درجة حرارة انصهار الحمض النووي (أي درجة الحرارة ، مع اللحاء ، يتم فصل 50 ٪ من خيوط الحمض النووي المزدوجة إلى خيوط أحادية الجديلة).

· NTF - nucleotide triphosphates هي مونومرات مباشرة للأحماض النووية. يوصى بنسبة متساوية من جميع النوكليوتيدات الأربعة ثلاثي الفوسفات لمنع إنهاء السلسلة. يزيد التركيز المنخفض لهذه المكونات في خليط التفاعل من احتمال حدوث أخطاء في بناء خيط DNA تكميلي.

· البادئات - الأفضل هو استخدام البادئات مع اختلاف درجة انصهار لا يزيد عن 2-4 ا C. في بعض الأحيان أثناء التخزين المطول عند درجة حرارة 4 ا مع أو بعد عدد كبير من التجميد - الذوبان ، تشكل البادئات هياكل ثانوية - ثنائيات ، مما يقلل من كفاءة PCR. يتم تقليل القضاء على هذه المشكلة إلى الحضانة في حمام مائي (T = 95 ا ج) لمدة 3 دقائق ثم تبريد حاد لاحق إلى 0 درجة مئوية مع.

· مستحضرات DNA - تؤثر كمية ونوعية تحضير DNA (المصفوفة) بشكل مباشر على مسار ومعلمات تفاعل البلمرة المتسلسل. الكمية الزائدة من عينة الحمض النووي تمنع تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). يمكن أن تقلل شوائب المواد المختلفة في تحضير الحمض النووي أيضًا من كفاءة تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR): أسيتات الصوديوم ، كلوريد الصوديوم ، الأيزوبروبانول ، الإيثانول ، الهيبارين ، الفينول ، اليوريا ، الهيموجلوبين ، إلخ.

· بوليميريز الحمض النووي - عند استخدام كمية صغيرة من بوليميريز الحمض النووي ، لوحظ انخفاض في تخليق المنتج النهائي بما يتناسب بشكل مباشر مع حجم الأجزاء. تؤدي الزيادة في البوليميراز بمعامل 2-4 إلى ظهور أطياف منتشرة وبعامل من 4 إلى 16 من أطياف غير محددة ذات وزن جزيئي منخفض. نطاق التركيزات المستخدمة هو 0.5 - 1.5 وحدة نشاط لكل 25 ميكرولتر من خليط PCR.

بالإضافة إلى المكونات الرئيسية لخليط PCR ، يتم استخدام عدد من المواد الإضافية التي تعمل على تحسين المعلمات النوعية والكمية لـ PCR: أسيتاميد (5 ٪) - زيادة في قابلية ذوبان المكونات الرئيسية ؛ البيتين ( ملح الصوديوم) - تثبيت بوليميراز الحمض النووي ، وخفض نقطة انصهار الحمض النووي ، وتسوية نقطة الانصهار ؛ الزلال البقري (10-100 ميكروغرام / مل) - استقرار بوليميريز الحمض النووي ؛ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (1-10٪) - زيادة قابلية ذوبان المكونات الرئيسية ؛ فورماميد (2-10٪) - زيادة في خصوصية التلدين ؛ الجلسرين (15-20 ٪) - زيادة في الاستقرار الحراري للإنزيم ، وانخفاض في درجة حرارة تمسخ عينة الحمض النووي ؛ كبريتات الأمونيوم - خفض درجة حرارة التمسخ والتليين.

1.5.2 الظروف الدورية ودرجة الحرارة

النظرة العامة لبرنامج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هي كما يلي:

المسرح. التمسخ الأولي طويل الأمد لتحضير الحمض النووي .1 دورة

المسرح. التمسخ السريع لتحضير الحمض النووي. تلدين البرايمر. استطالة 30-45 دورة.

المسرح. استطالة طويلة المدى. تبريد خليط التفاعل دورة واحدة.

كل عنصر من عناصر المرحلة - التمسخ ، التلدين ، الاستطالة - له خصائص فردية لدرجة الحرارة والوقت. يتم تحديد معلمات درجة الحرارة ووقت التدفق لكل عنصر بشكل تجريبي ، وفقًا للمؤشرات النوعية والكمية لمنتجات التضخيم.

تمسخ. أثناء هذا العنصر من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ينقسم جزيء DNA مزدوج الشريطة إلى جزئين أحاديي السلسلة. معلمات درجة الحرارة للتمسخ في حدود 90-95 ا ج ، ولكن في حالة وجود عينة من الحمض النووي نسبة عاليةالجوانين والسيتوزين ، يجب زيادة درجة الحرارة إلى 98 ا C. يجب أن تكون درجة حرارة التمسخ كافية للتمسخ الكامل - انقسام خيوط الحمض النووي وتجنب "التبريد المفاجئ" أو التلدين السريع ، ومع ذلك ، فإن بوليميراز الحمض النووي القابل للحرارة يكون أقل استقرارًا في درجات الحرارة المرتفعة. وبالتالي ، فإن اختيار معلمات درجة الحرارة المثلى للتمسخ لنسبة التمهيدي / العينة (تحضير الحمض النووي) يعد شرطًا مهمًا لإجراء التضخيم. إذا كانت درجة حرارة التمسخ في المرحلة الأولى أعلى من 95 ا C ، يوصى بإضافة بوليميريز DNA إلى خليط التفاعل بعد التمسخ الأولي. يجب أن تكون مدة عنصر المرحلة هذا في مسار تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) كافية لتمسخ الحمض النووي بالكامل ، ولكن في نفس الوقت لا يكون لها تأثير كبير على نشاط بوليميريز الحمض النووي عند درجة حرارة معينة.

التلدين. درجة حرارة التلدين (T. أ ) أحد أهم عوامل تفاعل البلمرة المتسلسل. يتم تحديد درجة حرارة التلدين لكل أساس تمهيدي على حدة. يعتمد ذلك على طول وتكوين النيوكليوتيدات في التمهيدي. عادة ما يكون أقل بمقدار 2 - 4 ا قيمة نقطة الانصهار (T م ) التمهيدي. إذا كانت درجة حرارة التلدين للنظام أقل من درجة الحرارة المثلى ، فإن عدد الأجزاء المضخمة غير المحددة يزداد ، وعلى العكس ، يزيد الحرارةيقلل من كمية المنتجات المضخمة. في هذه الحالة ، يمكن أن ينخفض تركيز الأمبليكونات المحددة بشكل حاد ، حتى تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تؤدي زيادة وقت التلدين أيضًا إلى زيادة عدد الأمبليكونات غير المحددة.

استطالة. عادةً ما يكون لكل نوع من أنواع بوليميراز الحمض النووي القابل للحرارة درجة حرارة فردية مثالية للنشاط. يعد معدل تخليق حبلا DNA التكميلي بواسطة الإنزيم أيضًا قيمة خاصة بكل بوليميراز (في المتوسط ، يكون 30-60 نيوكليوتيدًا في الثانية ، أو 1-2 ألف قاعدة في الدقيقة) ، لذلك يتم تحديد وقت الاستطالة اعتمادًا على على نوع DNA polymerase وطول المنطقة المضخمة.

1.5.3 المبادئ الأساسية لاختيار التمهيدي

عند إنشاء نظام اختبار PCR ، تتمثل إحدى المهام الرئيسية في الاختيار الصحيح للبادئات ، والتي يجب أن تفي بعدد من المعايير:

يجب أن تكون البرايمرات محددة. انتباه خاصدفع 3 - نهايات البادئات ، لأنها تبدأ من طق بوليميراز في تكوين حبلا DNA التكميلي. إذا كانت خصوصيتها غير كافية ، فمن المحتمل أن تحدث عمليات غير مرغوب فيها في أنبوب الاختبار مع خليط التفاعل ، أي تخليق الحمض النووي غير المحدد (شظايا قصيرة أو طويلة). يمكن رؤيته في الرحلان الكهربي في شكل نطاقات إضافية ثقيلة أو خفيفة. يتداخل هذا مع تقييم نتائج التفاعل ، لأنه من السهل الخلط بين منتج تضخيم معين و DNA خارجي مركب. يتم استهلاك بعض البادئات و dNTPs لتخليق الحمض النووي غير المحدد ، مما يؤدي إلى فقدان كبير للحساسية.

لا ينبغي أن تشكل مواد التمهيدي ثنائيات وحلقات ، أي لا ينبغي تشكيل سلاسل مزدوجة مستقرة نتيجة لصلب الاشعال لنفسها أو لبعضها البعض.

1.5.4 تأثير "الهضبة"

وتجدر الإشارة إلى أن عملية تراكم منتجات تضخيم محددة في تقدم هندسي تستمر لفترة محدودة فقط ، ومن ثم تنخفض كفاءتها بشكل كبير. ويرجع ذلك إلى ما يسمى بتأثير "الهضبة".

مصطلح التأثير هضبة تستخدم لوصف تراكم نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل خلال دورات التضخيم الأخيرة.

اعتمادًا على الظروف وعدد دورات تفاعل التضخيم ، في وقت تحقيق التأثير هضبة استخدام الركائز (dNTPs والبادئات) ، واستقرار المواد المتفاعلة (dNTPs والإنزيمات) ، وعدد المثبطات ، بما في ذلك بيروفوسفات ومزدوجات الحمض النووي ، والتنافس على المواد المتفاعلة مع منتجات غير محددة أو مثبطات أولية ، وتركيز منتج معين ، وتمسخ غير كامل عند تركيز عالٍ من منتجات التضخيم تتأثر.

كلما انخفض التركيز الأولي للحمض النووي المستهدف ، زادت مخاطر رد الفعل هضبة. "قد تأتي هذه النقطة قبل أن تكون كمية منتجات التضخيم المحددة كافية لتحليلها ، ولا يمكن تجنب ذلك إلا من خلال أنظمة الاختبار المُحسَّنة جيدًا.

1.5.5 تحضير عينة من المادة البيولوجية

لاستخراج الحمض النووي ، يتم استخدام تقنيات مختلفة ، اعتمادًا على المهام. يكمن جوهرها في استخراج (استخراج) الحمض النووي من منتج بيولوجي وإزالة الشوائب أو تحييدها للحصول على تحضير DNA بنقاء مناسب لـ PCR.

تعتبر طريقة الحصول على تحضير DNA النقي ، التي وصفها Marmur ، قياسية وأصبحت بالفعل كلاسيكية. ويشمل التحلل البروتيني الأنزيمي يليه نزع البروتين وإعادة ترسيب الحمض النووي بالكحول. تسمح لك هذه الطريقة بالحصول على تحضير DNA نقي. ومع ذلك ، فهو شاق للغاية وينطوي على العمل مع المواد العدوانية واللاذعة مثل الفينول والكلوروفورم.

إحدى الطرق الشائعة حاليًا هي طريقة استخراج الحمض النووي التي اقترحها Boom et al. تعتمد هذه الطريقة على استخدام عامل تشوتروبيك قوي ، غوانيدين ثيوسيانات (GuSCN) ، لتحلل الخلايا ، وامتصاص الحمض النووي اللاحق على الناقل (خرز زجاجي ، تراب دياتومي ، زجاج "حليب" ، إلخ). بعد الغسيل ، يبقى الحمض النووي في العينة ، ويتم امتصاصه على الناقل ، ويمكن إزالته بسهولة باستخدام محلول شطف. الطريقة مناسبة وتكنولوجية ومناسبة لإعداد عينة للتضخيم. ومع ذلك ، فإن فقد الحمض النووي ممكن بسبب الامتصاص الذي لا رجوع فيه على الناقل ، وكذلك أثناء عمليات الغسل العديدة. هذا مهم بشكل خاص عند العمل بكميات صغيرة من الحمض النووي في العينة. بالإضافة إلى ذلك ، حتى الكميات الضئيلة من GuSCN يمكن أن تمنع تفاعل البوليميراز المتسلسل. لذلك ، عند استخدام هذه الطريقة ، من المهم جدًا الاختيار الصحيحمراعاة الفروق التكنولوجية الدقيقة والمواد الماصة.

تعتمد مجموعة أخرى من طرق تحضير العينة على استخدام المبادلات الأيونية من نوع Chilex ، والتي ، على عكس الزجاج ، لا تمتص الحمض النووي ، ولكن على العكس من ذلك ، الشوائب التي تتداخل مع التفاعل. كقاعدة عامة ، تشتمل هذه التقنية على مرحلتين: غليان العينة وامتصاص الشوائب في المبادل الأيوني. الطريقة جذابة للغاية لبساطتها في التنفيذ. في معظم الحالات ، يكون مناسبًا للعمل مع المواد السريرية. لسوء الحظ ، توجد أحيانًا عينات بها شوائب لا يمكن إزالتها باستخدام المبادلات الأيونية. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن تدمير بعض الكائنات الحية الدقيقة عن طريق الغليان البسيط. في هذه الحالات ، من الضروري إدخال مراحل إضافية لمعالجة العينات.

وبالتالي ، ينبغي النظر في اختيار طريقة تحضير العينة مع فهم أهداف التحليلات المقصودة.

1.5.6 التضخيم

لإجراء تفاعل التضخيم ، من الضروري تحضير خليط تفاعل وإضافة عينة الحمض النووي التي تم تحليلها إليه. في هذه الحالة ، من المهم مراعاة بعض ميزات التلدين التمهيدي. الحقيقة هي أنه ، كقاعدة عامة ، تحتوي العينة البيولوجية التي تم تحليلها على مجموعة متنوعة من جزيئات الحمض النووي ، والتي تحتوي البادئات المستخدمة في التفاعل على تناظر جزئي ، وفي بعض الحالات مهم. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تصلب البرايمر مع بعضها البعض لتشكيل ثنائيات التمهيدي. كلاهما يؤدي إلى استهلاك كبير من المواد الأولية لتركيب منتجات تفاعل المنتج الثانوي (غير المحدد) ، ونتيجة لذلك ، يقلل بشكل كبير من حساسية النظام. هذا يجعل من الصعب أو المستحيل قراءة نتائج التفاعل أثناء الرحلان الكهربي.

1.6 تكوين خليط تفاعل PCR القياسي

x عازلة PCR (100 ملي محلول Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 9.0 ، 500 ملي محلول بوكل ، 25 ملي مولار محلول MgCl2 ) ……. 2.5 ميكرولتر

ماء (مللي) ……………………………………………………… .18.8 ميكرولتر

خليط النوكليوتيدات ثلاثي الفوسفات (dNTPs)

ملم محلول كل .................................................. ............ 0.5 ميكرولتر

التمهيدي 1 (10 ملي محلول) …………………………………………….… .1 ميكرولتر

التمهيدي 2 (10 ملي محلول) ………………………………………… ..… .1 ميكرولتر

بوليميراز الحمض النووي (5 وحدات / ميكرولتر) ................................................................... 0.2 ميكرولتر

عينة الحمض النووي (20 نانوغرام / ميكرولتر) …………………………………………… .. 1 ميكرولتر

1.7 تقييم نتائج التفاعل

للحصول على تقييم صحيح لنتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل ، من المهم أن نفهم أن هذه الطريقة ليست كمية. من الناحية النظرية ، يمكن الكشف عن منتجات تضخيم جزيئات الحمض النووي الفردية المستهدفة عن طريق الرحلان الكهربي بعد 30-35 دورة. ومع ذلك ، من الناحية العملية ، يتم ذلك فقط في الحالات التي يحدث فيها رد الفعل في ظل ظروف قريبة من المثالية ، والتي لا تحدث غالبًا في الحياة. درجة نقاء تحضير الحمض النووي لها تأثير كبير بشكل خاص على كفاءة التضخيم ، أي وجود مثبطات معينة في خليط التفاعل والتي يصعب التخلص منها في بعض الحالات. في بعض الأحيان ، بسبب وجودها ، لا يمكن تضخيم حتى عشرات الآلاف من جزيئات الحمض النووي المستهدفة. وبالتالي ، لا توجد غالبًا علاقة مباشرة بين المقدار الأولي من الحمض النووي المستهدف والكمية النهائية لمنتجات التضخيم.

الفصل 2: تطبيقات تفاعل البلمرة المتسلسل

يستخدم PCR في العديد من المجالات للتحليل والتجارب العلمية.

التحاليل الجنائية

يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل لمقارنة ما يسمى "بصمات الأصابع الجينية". مطلوب عينة من مادة وراثية من مسرح الجريمة - دم ، لعاب ، سائل منوي ، شعر ، إلخ. يتم مقارنته بالمادة الجينية للمشتبه به. كمية صغيرة جدًا من الحمض النووي كافية ، من الناحية النظرية - نسخة واحدة. ينقسم الحمض النووي إلى أجزاء ، ثم يتم تضخيمه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. يتم فصل الأجزاء بواسطة الرحلان الكهربائي للحمض النووي. تسمى الصورة الناتجة لموقع نطاقات الحمض النووي بالبصمة الجينية.

إثبات الأبوة

نتائج الرحلان الكهربي لشظايا الحمض النووي التي يتم تضخيمها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). أب. طفل. الأم. ورث الطفل بعض خصائص البصمة الجينية لكلا الوالدين ، مما أعطى بصمة جديدة وفريدة من نوعها.

على الرغم من أن البصمات الجينية فريدة من نوعها ، إلا أنه لا يزال من الممكن إنشاء روابط عائلية من خلال عمل بصمات متعددة. يمكن تطبيق نفس الطريقة ، مع تعديل طفيف ، لتأسيس القرابة التطورية بين الكائنات الحية.

التشخيصات الطبية

يتيح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تسريع تشخيص الأمراض الوراثية والفيروسية وتسهيله بشكل كبير. يتم تضخيم الجين المطلوب بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات المناسبة ثم تسلسلها لاكتشاف الطفرات. العدوى الفيروسيةيمكن الكشف عنها مباشرة بعد الإصابة ، قبل أسابيع أو شهور من ظهور أعراض المرض.

طب شخصي

في بعض الأحيان تكون الأدوية سامة أو مسببة للحساسية لبعض المرضى. تعود أسباب ذلك جزئيًا إلى الفروق الفردية في القابلية للتأثر بالأدوية ومشتقاتها واستقلابها. يتم تحديد هذه الاختلافات على المستوى الجيني. على سبيل المثال ، في مريض واحد ، قد يكون السيتوكروم أكثر نشاطًا ، في مريض آخر - أقل. من أجل تحديد نوع السيتوكروم الذي يمتلكه مريض معين ، تم اقتراح إجراء تحليل PCR قبل استخدام الدواء. يسمى هذا التحليل التنميط الجيني المسبق.

استنساخ الجينات

الاستنساخ الجيني هو عملية عزل الجينات ، ونتيجة للتلاعب بالهندسة الوراثية ، الحصول على كمية كبيرة من منتج جين معين. يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم الجين ، والذي يتم إدخاله بعد ذلك في ناقل - قطعة من الحمض النووي تنقل جينًا غريبًا إلى كائن حي أو كائن آخر مناسب للنمو. كما يتم استخدام ناقلات ، على سبيل المثال ، البلازميدات أو الحمض النووي الفيروسي. عادة ما يستخدم إدخال الجينات في كائن غريب للحصول على منتج هذا الجين - RNA أو في كثير من الأحيان بروتين. وبالتالي ، يتم الحصول على العديد من البروتينات بكميات صناعية لاستخدامها في الزراعة والطب وما إلى ذلك.

تسلسل الحمض النووي

في طريقة التسلسل باستخدام النظائر المشعة dideoxynucleotides ، يعتبر تفاعل البوليميراز المتسلسل جزءًا لا يتجزأ ، لأنه أثناء البلمرة يتم دمج مشتقات النيوكليوتيدات الموصوفة بعلامة الفلورسنت أو المشعة في حبلا DNA. هذا يوقف التفاعل ، مما يسمح بتحديد موضع نيوكليوتيدات معينة بعد فصل الخيوط المركبة في الهلام.

الطفرات

حاليًا ، أصبح تفاعل البوليميراز المتسلسل الطريقة الرئيسية لإجراء الطفرات. أتاح استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تبسيط إجراءات إجراء الطفرات وتسريعها ، فضلاً عن جعلها أكثر موثوقية وقابلية للتكاثر.

أتاحت طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل تحليل وجود متواليات فيروس الورم الحليمي البشري في أقسام خزعة من أورام عنق الرحم البشرية المضمنة في البارافين قبل 40 عامًا من هذه الدراسة. علاوة على ذلك ، بمساعدة PCR ، كان من الممكن تضخيم واستنساخ أجزاء من الحمض النووي للميتوكوندريا من البقايا الأحفورية لدماغ الإنسان التي يبلغ عمرها 7 آلاف عام!

تم إثبات القدرة على تحليل موقعين في وقت واحد يقعان على كروموسومات مختلفة غير متجانسة في محللات الحيوانات المنوية البشرية الفردية. يوفر هذا النهج فرصة فريدةالتحليل الجيني الدقيق ودراسة إعادة التركيب الكروموسومي ، وتعدد أشكال الحمض النووي ، وما إلى ذلك ، وجدت طريقة تحليل الحيوانات المنوية الفردية على الفور تطبيقًا عمليًا في الطب الشرعي ، نظرًا لأن تصنيف HLA للخلايا أحادية الصيغة الصبغية يجعل من الممكن تحديد الأبوة أو تحديد الجاني (مجمع HLA هي مجموعة من الجينات لمركب التوافق النسيجي البشري الرئيسي ؛ تعد مواضع مركب HLA الأكثر تعددًا للأشكال من بين جميع الأنواع المعروفة في الفقاريات العليا: يوجد داخل الأنواع في كل موضع عدد كبير بشكل غير عادي من الأليلات المختلفة - أشكال بديلة من نفس الجين ).

باستخدام PCR ، من الممكن الكشف عن صحة تكامل الهياكل الوراثية الأجنبية في منطقة محددة مسبقًا من جينوم الخلايا قيد الدراسة. يتم تلدين الحمض النووي الخلوي الكلي باستخدام اثنين من بادئات قليل النوكليوتيد ، أحدهما مكمل لمنطقة DNA المضيف بالقرب من نقطة الإدخال ، والآخر لتسلسل الجزء المتكامل في خيط DNA المضاد للتوازي. في حالة وجود بنية DNA كروموسومية غير متغيرة في موقع الإدخال المقترح ، يؤدي تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى تكوين شظايا DNA أحادية الجديلة ذات حجم غير محدد ، وفي حالة الإدخال المخطط ، شظايا DNA مزدوجة الشريطة من a حجم معروف ، تحدده المسافة بين مواقع التلدين لاثنين من البادئات. علاوة على ذلك ، فإن درجة تضخيم المنطقة التي تم تحليلها من الجينوم في الحالة الأولى ستعتمد خطيًا على عدد الدورات ، وفي الحالة الثانية - الأسي. يتيح التراكم الأسي لجزء مضخم بحجم معروف سابقًا أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مراقبته بصريًا بعد التجزئة الكهربي لتحضير الحمض النووي والتوصل إلى استنتاج لا لبس فيه حول إدخال تسلسل أجنبي في منطقة معينة من الحمض النووي الصبغي.

استنتاج

يتم حاليًا تلقي أكثر طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل انتشارًا كوسيلة لتشخيص الأمراض المعدية المختلفة. يسمح لك تفاعل البوليميراز المتسلسل بتحديد مسببات العدوى ، حتى لو كانت العينة المأخوذة للتحليل تحتوي فقط على عدد قليل من جزيئات الحمض النووي لمسببات الأمراض. يستخدم PCR على نطاق واسع في التشخيص المبكر لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية ، التهاب الكبد الفيروسيإلخ. اليوم ، لا يوجد عامل معدي تقريبًا لا يمكن اكتشافه باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل.

قائمة الأدب المستخدم

1.Padutov V.E. ، Baranov O.Yu. ، Voropaev E.V. طرق التحليل الجيني الجزيئي. - مينسك: يونيبول ، 2007. - 176 ص.

2.PCR "في الوقت الفعلي" / Rebrikov DV ، Samatov GA ، Trofimov D.Yu. وإلخ.؛ إد. د - ب. ن. د. ريبريكوف. مقدمة لوس انجليس اوسترمان واكاد. RAS و RAAS E.D. سفيردلوف. الطبعة الثانية ، القس. و أضف. - م: BINOM. مختبر المعرفة ، 2009. - 223 ص.

.باتروشيف ل. أنظمة وراثية اصطناعية. - م: نوكا ، 2005. - في مجلدين

.B. Glick ، J. Pasternak Molecular Biotechnology. المبادئ والتطبيق 589 صفحة ، 2002

5.Shchelkunov S.N. الهندسة الوراثية. - نوفوسيبيرسك: Sib. جامعة. دار النشر ، 2004. - 496 ص.

حرره أ. فوربييفا "تفاعل البلمرة المتسلسل وتطبيقاته في التشخيص في طب الأمراض الجلدية والتناسلية" ؛ وكالة أنباء طبية - 72 ص.

المتشعب: // ru. wikipedia.org

المتشعب: // الباحث. google.ru

http://www.med2000.ru/n1/n12. هتم

12.http: // prizvanie. سو / - مجلة طبية

دروس خصوصية

بحاجة الى مساعدة في استكشاف موضوع؟

سيقوم خبراؤنا بتقديم المشورة أو تقديم خدمات التدريس حول الموضوعات التي تهمك.
ارسل طلبمع الإشارة إلى الموضوع الآن للتعرف على إمكانية الحصول على استشارة.

مبدأ الطريقة (الأساس البيولوجي الجزيئي)

من بين مجموعة متنوعة من طرق التهجين لتحليل الحمض النووي ، تستخدم طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على نطاق واسع في التشخيصات المخبرية السريرية.

مبدأ الطريقة تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)(تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)) تم تطويره بواسطة Carey Mullis (Cetus ، الولايات المتحدة الأمريكية) في عام 1983. ويستخدم الآن على نطاق واسع في كل من البحث العلمي والتشخيص في مجال الرعاية الصحية العملية وخدمة المراقبة الصحية والوبائية الحكومية (التنميط الجيني وتشخيص الأمراض المعدية).

تعتمد طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على عملية طبيعية - إكمال تكميلي لمصفوفة الحمض النووي ، يتم إجراؤه بمساعدة إنزيم بوليميريز الحمض النووي. يسمى هذا التفاعل تكرار الحمض النووي.

يتضمن تكرار الحمض النووي الطبيعي عدة مراحل:

1) تمسخ الحمض النووي(عدم نسج اللولب المزدوج ، تباعد خيوط الحمض النووي) ؛

2) تشكيل مناطق DNA قصيرة مزدوجة الشريطة(البادئات المطلوبة لبدء تخليق الحمض النووي) ؛

3) تخليق خيط DNA جديد(استكمال تكميلي لكلا الخيوط)

يمكن استخدام هذه العملية للحصول على نسخ أقسام DNA قصيرة خاصة بكائنات دقيقة محددة ،أولئك. إجراء بحث مستهدف لمثل هذه المناطق المحددة ، وهو الغرض من التشخيص الجيني للتعرف على مسببات الأمراض المعدية.

اكتشاف بوليميراز DNA القابل للحرارة (بوليميراز طاق) من البكتيريا المحبة للحرارة Thermis aquaticus، التي يكون الحد الأقصى لها في منطقة 70-72 درجة مئوية ، جعل من الممكن جعل عملية تكرار الحمض النووي دورية واستخدامها في العمل في المختبر. إنشاء منظمات الحرارة القابلة للبرمجة (مكبرات الصوت) ، والتي ، وفقًا لبرنامج معين ، تغير درجات الحرارة بشكل دوري ، مما خلق الشروط المسبقة لإدخال طريقة PCR على نطاق واسع في الممارسة المختبرية. التشخيص السريري... مع التكرار المتعدد لدورات التخليق ، تحدث زيادة أسية في عدد نسخ جزء معين من الحمض النووي ، مما يسمح بالحصول على عدد كافٍ من نسخ الحمض النووي من كمية صغيرة من المواد التي تم تحليلها ، والتي قد تحتوي على خلايا مفردة من الكائنات الحية الدقيقة ، لتحديد الهوية عن طريق الكهربائي.

لا يبدأ إكمال الخيط التكميلي في أي نقطة في تسلسل الحمض النووي ، ولكن فقط في كتل بداية معينة ، مناطق قصيرة مزدوجة الشريطة. عندما يتم ربط هذه الكتل بمناطق معينة من الحمض النووي ، فمن الممكن توجيه توليف خيط جديد فقط في هذه المنطقة ، وليس على طول سلسلة الحمض النووي بالكامل. لإنشاء كتل البداية في مناطق محددة من الحمض النووي ، يتم استخدام اثنين من بادئات قليلة النوكليوتيد (20 زوجًا من النيوكليوتيدات) ، تسمى الاشعال.تعتبر البادئات مكملة لتسلسل الحمض النووي على الحدود اليمنى واليسرى لجزء معين ويتم توجيهها بطريقة تجعل إكمال خيط DNA الجديد يحدث بينهما فقط.

وبالتالي ، فإن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو زيادة متعددة في عدد النسخ (التضخيم) لمنطقة معينة من الحمض النووي ، يتم تحفيزها بواسطة إنزيم بوليميريز الحمض النووي.

لإجراء التضخيم ، يلزم توفر المكونات التالية:

خليط ديوكسينوكليوتيد ثلاثي الفوسفات (dNTP)(خليط من أربعة dNTPs ، وهي مادة لتركيب خيوط DNA تكميلية جديدة)

انزيم طق بوليميراز(بوليميراز DNA القابل للحرارة الذي يحفز إطالة سلاسل التمهيدي عن طريق الارتباط المتسلسل لقواعد النوكليوتيدات بالسلسلة المتنامية للحمض النووي المركب).

محلول منظم(وسط تفاعل يحتوي على Mg2 + أيونات مطلوب للحفاظ على نشاط الإنزيم)
لتحديد مناطق معينة من جينوم الفيروسات المحتوية على RNA ، يتم الحصول أولاً على نسخة DNA من قالب RNA باستخدام تفاعل النسخ العكسي (RT) المحفز بواسطة إنزيم النسخ العكسي (النسخ العكسي).

للحصول على عدد كافٍ من نسخ جزء DNA المميز المطلوب ، يشتمل التضخيم على عدة دورات (20-40).

تتضمن كل دورة تضخيم 3 مراحل ، تجري في ظروف درجات حرارة مختلفة

المرحلة 1: تمسخ الحمض النووي(غير المنسوجة لولب مزدوج). تعمل عند 93-95 درجة مئوية لمدة 30-40 ثانية.

المرحلة الثانية: تركيب البادئات (التلدين).يحدث إرفاق البادئات مكملًا للتسلسلات المقابلة على خيوط DNA المعاكسة عند حدود موقع معين. كل زوج من البادئات له درجة حرارة التلدين الخاصة به ، والتي تتراوح قيمها بين 50-65 درجة مئوية. وقت التلدين -20-60 ثانية.

المرحلة 3: استكمال سلاسل الحمض النووي.يحدث التمديد التكميلي لخيوط الحمض النووي من 5'-end إلى 3'-end of the strand في اتجاهات متعاكسة ، بدءًا من مواقع التعلق التمهيدي. تضاف ديوكسي ريبونوكليوتيد ثلاثي الفوسفات (dNTP) إلى المحلول كمواد لتركيب خيوط DNA جديدة. يتم تحفيز عملية التوليف بواسطة إنزيم بوليميراز DNA القابل للحرارة (Taq polymerase) وتحدث عند درجة حرارة 70-72 درجة مئوية. مدة التركيب 20-40 ثانية.

تعمل خيوط الحمض النووي الجديدة التي تشكلت في الجولة الأولى من التضخيم كقوالب للجولة الثانية من التضخيم ، حيث يتم تشكيل جزء DNA المحدد المطلوب (amplicon). (انظر الشكل 2). في الجولات اللاحقة من التضخيم ، تعمل الأمبليكون كقالب لتركيب خيوط جديدة. وبالتالي ، هناك تراكم من الأمبليكون في المحلول وفقًا للصيغة 2n ، حيث n هو عدد دورات amplicon. لذلك ، حتى لو كان هناك في البداية جزيء DNA مزدوج الشريطة في المحلول الأولي ، فإن حوالي 108 جزيء أمبليكون تتراكم في المحلول خلال 30-40 دورة. هذه الكمية كافية للكشف البصري الموثوق به عن هذا الجزء عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. تتم عملية التضخيم في منظم حرارة خاص قابل للبرمجة (مكبر للصوت) ، والذي ، وفقًا لبرنامج معين ، يغير درجات الحرارة تلقائيًا وفقًا لعدد دورات التضخيم.

مراحل PCR - التحليل

في قلب طريقة PCR كأداة التشخيص المختبريتكمن الأمراض المعدية في اكتشاف جزء صغير من الحمض النووي للعامل الممرض (عدة مئات من أزواج القواعد) ، خاصة فقط بكائن دقيق معين ، باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لتجميع الجزء المطلوب.
تتضمن تقنية التحليل باستخدام طريقة PCR ثلاث مراحل:

1. عزل DNA (RNA) من عينة سريرية

2. تضخيم شظايا DNA معينة
3. الكشف عن منتجات التضخيم

عزل DNA (RNA)
في هذه المرحلة من التحليل ، تخضع العينة السريرية لمعالجة خاصة ، ونتيجة لذلك يحدث تحلل المادة الخلوية ، وإزالة جزيئات البروتين والسكريات ، وإنتاج محلول DNA أو RNA خالٍ من
مثبطات وجاهزة لمزيد من التضخيم.
يتم تحديد اختيار تقنية عزل DNA (RNA) بشكل أساسي من خلال طبيعة المواد السريرية المعالجة.

تضخيم شظايا DNA معينة
في هذه المرحلة ، هناك تراكم لشظايا DNA قصيرة محددة بالكمية اللازمة لمزيد من الكشف عنها. تستخدم معظم طرق تحديد أجزاء معينة من الجينوم ما يسمى ب. "النسخة الكلاسيكية من PCR الموجه. لزيادة خصوصية وحساسية الاختبار ، تستخدم بعض الطرق طريقة PCR "المتداخلة" ، والتي تستخدم زوجين من البادئات ("خارجي" - للمرحلة 1 ، و "داخلي" - للمرحلة 2).

الكشف عن منتجات التضخيم
في معظم الطرق ، في هذه المرحلة ، يتم فصل خليط منتجات التضخيم التي تم الحصول عليها في المرحلة الثانية بواسطة رحلان كهربائي أفقي في هلام الاغاروز. قبل الفصل الكهربي ، يضاف محلول بروميد إيثيديوم إلى خليط التضخيم ، والذي يشكل مركبات إدخال قوية مع شظايا DNA مزدوجة الشريطة. تحت تأثير الأشعة فوق البنفسجية ، تكون هذه المركبات قادرة على التألق ، والتي يتم تسجيلها في شكل شرائط مضيئة برتقالية حمراء بعد الفصل الكهربائي لخليط التضخيم في هلام الاغاروز.

كبديل لطريقة الكشف الكهربي ، والتي لها بعض العيوب: يمكن اقتراح ذاتية قراءة النتائج ، والقيود على تحديد الحمض النووي للعديد من الكائنات الحية الدقيقة في تفاعل واحد. مخططات الكشف عن التهجين.في هذه المخططات ، يتم تهجين جزء الحمض النووي الناتج عن التضخيم (يشكل مجمعات ثنائية الخيط - "هجينة") باستخدام مسبار قليل النوكليوتيد المحدد. يمكن إجراء تسجيل مثل هذه المجمعات بطريقة القياس اللوني أو الفلوري. تم إنشاء مجموعات الكشف على أساس التهجين مع التسجيل الفلوري للنتائج في SPF "Litekh"

مزايا طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل كطريقة لتشخيص الأمراض المعدية:

- التحديد المباشر لوجود مسببات الأمراض

كثير الطرق التقليديةالتشخيص ، على سبيل المثال ، مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ، يكشف عن البروتينات الواسمة التي هي نتاج النشاط الحيوي للعوامل المعدية ، والتي تعطي فقط دليلًا غير مباشر على وجود عدوى. إن تحديد منطقة معينة من DNA الممرض بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل يعطي مؤشراً مباشراً على وجود العامل الممرض.

- خصوصية عالية
تعود الخصوصية العالية لطريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى حقيقة أنه تم اكتشاف خاصية فريدة لجزء الحمض النووي فقط لمسببات الأمراض المعينة في مادة الاختبار. يتم تحديد الخصوصية من خلال تسلسل النوكليوتيدات في البادئات ، والذي يستبعد
إمكانية الحصول على نتائج خاطئة ، على عكس مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ، حيث تكون الأخطاء شائعة بسبب المستضدات المتفاعلة.

- حساسية عالية
تسمح لك طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل باكتشاف خلايا مفردة من البكتيريا أو الفيروسات. يكشف تشخيص PCR عن وجود مسببات الأمراض للأمراض المعدية في الحالات التي تكون فيها الطرق الأخرى (المناعية والبكتريولوجية ،
مجهري) لا يمكن القيام بذلك. تبلغ حساسية تحليل PCR 10-1000 خلية لكل عينة (حساسية الاختبارات المناعية والميكروسكوبية هي 103-105 خلية).

- عالمية إجراء تحديد مسببات الأمراض المختلفة
مادة البحث عن طريق طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل هي الحمض النووي للعامل الممرض. تعتمد الطريقة على تحديد جزء DNA أو RNA الخاص بكائن حي معين. يسمح تشابه التركيب الكيميائي لجميع الأحماض النووية باستخدام طرق موحدة للبحث المعملي. هذا يجعل من الممكن تشخيص العديد من مسببات الأمراض من خلال اختبار حيوي واحد. كمادة اختبار ، يمكن استخدام إفرازات بيولوجية مختلفة (المخاط والبول والبلغم) وكشط الخلايا الظهارية والدم والمصل.

- سرعة عالية لنتائج التحليل التي تم الحصول عليها
لا يتطلب تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل عزل واستنبات ثقافة العامل الممرض ، الأمر الذي يستغرق الكثير من الوقت. تتيح الطريقة الموحدة لمعالجة المواد الحيوية وكشف نواتج التفاعل وأتمتة عملية التضخيم إجراء تحليل كامل في 4-4.5 ساعات.

وتجدر الإشارة إلى أن طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل يمكن أن تكتشف مسببات الأمراض ليس فقط في المواد السريرية التي تم الحصول عليها من المريض ، ولكن أيضًا في المواد التي تم الحصول عليها من الكائنات البيئية (الماء ، التربة ، إلخ).

تطبيق طريقة PCR في الرعاية الصحية العملية

إن استخدام طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل لتشخيص الأمراض المعدية ذات الطبيعة البكتيرية والفيروسية له أهمية كبيرة في حل العديد من مشاكل علم الأحياء الدقيقة وعلم الأوبئة. يساهم تطبيق هذه الطريقة أيضًا في تطوير البحث الأساسي في مجال دراسة الأمراض المعدية المزمنة والقليلة الدراسة.

الاستخدام الأكثر فعالية وفعالية من حيث التكلفة للطريقة في:

ممارسة المسالك البولية النسائية- للكشف عن الكلاميديا ، ureaplasmosis ، السيلان ، الهربس ، داء البستنة ، عدوى الميكوبلازما ؛

في أمراض الرئة- ل تشخيص متباينالالتهاب الرئوي الفيروسي والبكتيري والسل.

في أمراض الجهاز الهضمي- التعرف على بكتيريا هيليكوباكتيريوسيس.

في عيادة الأمراض المعدية- كطريقة صريحة لتشخيص داء السلمونيلات والدفتيريا والفيروسات التهاب الكبد ب ، جو G ؛

في أمراض الدم- للكشف عن عدوى الفيروس المضخم للخلايا ، فيروسات الأورام.

1. تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

2. مبدأ طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل

2.1 وجود عدد من المكونات في خليط التفاعل

2.2 ظروف درجة الحرارة الدورية

2.3 المبادئ الأساسية لاختيار التمهيدي

2.4 تأثير "الهضبة"

3. مراحل إنتاج PCR

3.2 التضخيم

3.4.1 الضوابط الإيجابية

3.4.2 الضوابط الداخلية

4.1 التحليل النوعي

4.1.2 الكشف عن جزيئات الحمض النووي الريبي

3.1 تحضير عينة من المواد البيولوجية

إحدى الطرق الشائعة حاليًا هي طريقة استخراج الحمض النووي التي اقترحها Boom et al. تعتمد هذه الطريقة على استخدام عامل تشوتروبيك قوي ، غوانيدين ثيوسيانات (GuSCN) ، لتحلل الخلايا ، وامتصاص الحمض النووي اللاحق على الناقل (خرز زجاجي ، تراب دياتومي ، زجاج "حليب" ، إلخ). بعد الغسيل ، يبقى الحمض النووي في العينة ، ويتم امتصاصه على الناقل ، ويمكن إزالته بسهولة باستخدام محلول شطف. الطريقة مناسبة وتكنولوجية ومناسبة لإعداد عينة للتضخيم. ومع ذلك ، فإن فقد الحمض النووي ممكن بسبب الامتصاص الذي لا رجوع فيه على الناقل ، وكذلك أثناء عمليات الغسل العديدة. هذا مهم بشكل خاص عند العمل بكميات صغيرة من الحمض النووي في العينة. بالإضافة إلى ذلك ، حتى الكميات الضئيلة من GuSCN يمكن أن تمنع تفاعل البوليميراز المتسلسل. لذلك ، عند استخدام هذه الطريقة ، يكون الاختيار الصحيح للمواد الماصة والمراعاة الدقيقة للفروق التكنولوجية أمرًا مهمًا للغاية.

وبالتالي ، ينبغي النظر في اختيار طريقة تحضير العينة مع فهم أهداف التحليلات المقصودة.

3.2 التضخيم

3.3 تقييم نتائج التفاعل

3.3.1 طريقة التفريد الأفقي

يتم استخدام طرق مختلفة لتصور نتائج التضخيم. الطريقة الأكثر شيوعًا اليوم هي الرحلان الكهربائي ، بناءً على فصل جزيئات الحمض النووي حسب الحجم. للقيام بذلك ، قم بإعداد طبق من هلام الاغاروز ، والذي يتم تجميده بعد الذوبان في محلول رحلان كهربائي agarose بتركيز 1.5-2.5٪ مع إضافة صبغة DNA خاصة ، على سبيل المثال ، بروميد الإيثيديوم. يشكل الاغاروز المجمد شبكة مكانية. عند ملء الأمشاط ، يتم تشكيل آبار خاصة في الجل ، والتي يتم إدخال منتجات التضخيم إليها لاحقًا. يتم وضع لوحة الهلام في الجهاز من أجل الرحلان الكهربائي للهلام الأفقي ويتم توصيل المصدر الجهد المستمر... يبدأ الحمض النووي سالب الشحنة بالانتقال من سالب إلى موجب في الهلام. في هذه الحالة ، تتحرك جزيئات الحمض النووي الأقصر بشكل أسرع من الجزيئات الطويلة. تتأثر سرعة حركة الحمض النووي في الهلام بتركيز الاغاروز ، وقوة المجال الكهربائي ، ودرجة الحرارة ، وتكوين محلول الرحلان الكهربائي ، وبدرجة أقل ، بتكوين GC للحمض النووي. تتحرك جميع الجزيئات من نفس الحجم بنفس السرعة. يتم تضمين الصبغة (مقسمة) في مجموعات مستوية في جزيئات الحمض النووي. بعد نهاية الرحلان الكهربي ، الذي يستمر من 10 دقائق إلى ساعة واحدة ، يتم وضع الجل على مرشح مصباح ضوئي ينبعث منه الضوء في نطاق الأشعة فوق البنفسجية (254 - 310 نانومتر). يتم نقل طاقة الأشعة فوق البنفسجية التي يمتصها الحمض النووي في منطقة 260 نانومتر إلى الصبغة ، مما يتسبب في تألقها في المنطقة البرتقالية الحمراء من الطيف المرئي (590 نانومتر).

يمكن أن يكون سطوع نطاقات منتجات التضخيم مختلفًا. ومع ذلك ، لا يمكن أن يرتبط هذا بالكمية الأولية من الحمض النووي المستهدف في العينة.

3.3.2 طريقة الفصل الكهربائي العمودي

تشبه طريقة الرحلان الكهربي العمودي في الأساس طريقة الرحلان الكهربي الأفقي. يكمن اختلافهم في حقيقة أنه في هذه الحالة يتم استخدام المواد الهلامية المتعددة الأكريلاميد بدلاً من الاغاروز. يتم إجراؤه في غرفة خاصة للرحلان الكهربي العمودي. يتميز الرحلان الكهربي للهلام بولي أكريلاميد بدقة أعلى مقارنة بالرحلان الكهربي للأغاروز ويجعل من الممكن التمييز بين جزيئات الحمض النووي ذات الأحجام المختلفة بدقة نيوكليوتيد واحد. يعد تحضير هلام بولي أكريلاميد أكثر تعقيدًا إلى حد ما من هلام الاغاروز. بالإضافة إلى ذلك ، مادة الأكريلاميد مادة سامة. نظرًا لأن الحاجة إلى تحديد حجم منتج التضخيم بدقة 1 نيوكليوتيد نادرًا ما تظهر ، يتم استخدام طريقة الفصل الكهربائي الأفقي في العمل الروتيني.

3.4 التحكم في مرور تفاعل التضخيم

3.4.1 الضوابط الإيجابية

يتم استخدام تحضير الحمض النووي للكائن الدقيق المطلوب "كعنصر تحكم إيجابي". تختلف الأمبليكونات غير المحددة في الحجم عن الأمبليكون المتولدة عن طريق التضخيم باستخدام التحكم في إعداد الحمض النووي. يمكن أن يكون حجم المنتجات غير المحددة أكبر أو أصغر من عنصر التحكم الإيجابي. في أسوأ الحالات ، قد تتطابق هذه الأبعاد ويتم قراءتها على أنها موجبة في الرحلان الكهربائي.

للتحكم في خصوصية منتج التضخيم المتولد ، يمكن استخدام مجسات التهجين (مناطق الحمض النووي الموجودة داخل التسلسل المضخم) المسمى بعلامات الإنزيم أو النظائر المشعة والتفاعل مع الحمض النووي وفقًا لنفس مبادئ الاشعال. هذا يعقد التحليل ويطيل بشكل كبير ، وتزيد تكلفته بشكل كبير.

3.4.2 الضوابط الداخلية

من الضروري التحكم في تقدم التضخيم في كل أنبوب بخليط التفاعل. لهذا الغرض ، يتم استخدام عنصر إضافي يسمى "الرقابة الداخلية". هو أي تحضير DNA لا يشبه DNA الكائن الدقيق المستهدف. إذا تمت إضافة عنصر التحكم الداخلي إلى خليط التفاعل ، فسيصبح نفس الهدف من التلدين التمهيدي ، مثل الحمض النووي الصبغي للعامل المعدي المطلوب. يتم تحديد حجم منتج التضخيم للرقابة الداخلية بحيث يكون أكبر مرتين أو أكثر من الأمبليكون المتكونة من تضخيم الحمض النووي المطلوب للكائن الدقيق. نتيجة لذلك ، إذا تمت إضافة DNA الضبط الداخلي إلى خليط التفاعل مع عينة الاختبار ، فبغض النظر عن وجود الكائن الدقيق في العينة البيولوجية ، فإن التحكم الداخلي سوف يتسبب في تكوين أمبليكونات محددة ، ولكن لفترة أطول (ثقيلة) ) من أمبليكون الكائنات الحية الدقيقة. سيشير وجود الأمبليكون الثقيل في خليط التفاعل إلى التقدم الطبيعي لتفاعل التضخيم وغياب المثبطات. إذا لم يتم تشكيل أمبليكونات بالحجم المطلوب ، ولكن لم تتشكل أمبليكونات الرقابة الداخلية أيضًا ، فيمكن استنتاج أن هناك شوائب غير مرغوب فيها في العينة التي تم تحليلها ، والتي يجب إزالتها ، ولكن ليس بسبب عدم وجود الشوائب المرغوبة الحمض النووي.

لسوء الحظ ، على الرغم من كل جاذبية هذا النهج ، إلا أنه يحتوي على عيب كبير. إذا كان الحمض النووي المطلوب موجودًا في خليط التفاعل ، فعندئذٍ تنخفض كفاءة تضخيمه بشكل حاد بسبب المنافسة مع التحكم الداخلي في البادئات. هذا مهم بشكل خاص عند التركيزات المنخفضة للحمض النووي في عينة الاختبار ، مما قد يؤدي إلى نتائج سلبية خاطئة.

ومع ذلك ، إذا تم حل مشكلة المنافسة على البادئات ، فإن طريقة التحكم في كفاءة التضخيم ستكون بالتأكيد مفيدة للغاية.

4. طرق تعتمد على تفاعل البلمرة المتسلسل

4.1 التحليل النوعي

وجدت الطريقة الكلاسيكية لأداء PCR ، التي تم توضيح مبادئها أعلاه ، تطورها في بعض التعديلات التي تهدف إلى التغلب على قيود PCR وزيادة كفاءة التفاعل.

4.1.1 طريقة إعداد PCR باستخدام "بدء التشغيل السريع"

لتقليل مخاطر تكوين نواتج تفاعل تضخيم غير محددة ، يتم استخدام نهج "البدء الساخن" ، والذي يتكون من منع إمكانية بدء التفاعل قبل الوصول إلى الظروف في أنبوب الاختبار التي توفر تلدينًا محددًا للبادئات.

الحقيقة هي أنه ، اعتمادًا على تكوين GC وحجمها ، تحتوي البادئات على نقطة انصهار معينة (Tm). إذا تجاوزت درجة حرارة النظام Tm ، فلن يتمكن التمهيدي من الالتصاق بشريط الحمض النووي وتغيير الصفات. في ظل الظروف المثلى ، أي التلدين بدرجة حرارة قريبة من درجة حرارة الانصهار ، يشكل التمهيدي جزيء مزدوج الشريطة فقط بشرط تكامله الكامل ، وبالتالي يضمن خصوصية التفاعل.

هناك العديد من الخيارات لتنفيذ البدء السريع:

إدخال Taq-polymerase في خليط التفاعل خلال الدورة الأولى بعد تسخين الأنبوب إلى درجة حرارة تمسخ.

فصل مكونات خليط التفاعل بطبقة بارافين إلى طبقات (في الجزء السفلي - بادئات ، في الجزء العلوي - طاق بوليميريز وهدف DNA) ، والتي يتم خلطها عند ذوبان البارافين (~ 65-75 0 درجة مئوية) ).

استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة لـ Taq polymerase. يصبح الإنزيم المرتبط بالأجسام المضادة وحيدة النسيلة نشطًا فقط بعد مرحلة التمسخ الأولى ، عندما تفسد الأجسام المضادة أحادية النسيلة بشكل لا رجعة فيه وتحرر المواقع النشطة لـ Taq polymerase.

في جميع هذه الحالات ، حتى لو حدث التلدين غير المحدد قبل بداية دورة درجة الحرارة ، لا يحدث استطالة ، وعند التسخين ، يتم تغيير طبيعة معقدات DNA التمهيدي ، وبالتالي لا يتم تشكيل منتجات غير محددة. بعد ذلك ، لا تنخفض درجة الحرارة في أنبوب الاختبار عن درجة حرارة الانصهار ، مما يضمن تكوين منتج تضخيم محدد.

4.1.2 الكشف عن جزيئات الحمض النووي الريبي

إن إمكانية استخدام الحمض النووي الريبي كهدف لـ PCR يوسع بشكل كبير نطاق تطبيقات هذه الطريقة. على سبيل المثال ، يتم تمثيل جينومات العديد من الفيروسات (التهاب الكبد C ، وفيروس الأنفلونزا ، وفيروسات البيكورنا ، وما إلى ذلك) بواسطة الحمض النووي الريبي. في الوقت نفسه ، لا توجد مرحلة وسيطة للتحول إلى DNA في دورات حياتها. لاكتشاف الحمض النووي الريبي ، من الضروري أولاً وقبل كل شيء تحويله إلى شكل الحمض النووي. لهذا ، يتم استخدام النسخ العكسي ، والذي يتم عزله عن اثنين فيروسات مختلفة: فيروس الأرومة النقوية الطيرية وفيروس ابيضاض الدم في الفئران المولوني. يرتبط استخدام هذه الإنزيمات ببعض الصعوبات. بادئ ذي بدء ، فهي قابلة للتحلل الحراري وبالتالي يمكن استخدامها في درجات حرارة لا تزيد عن 42 درجة مئوية. نظرًا لأن جزيئات الحمض النووي الريبي في درجة الحرارة هذه تشكل هياكل ثانوية بسهولة ، تنخفض كفاءة التفاعل بشكل ملحوظ ، ووفقًا للتقديرات المختلفة ، تقارب 5٪. تُبذل محاولات للتحايل على هذا العيب باستخدام بوليميراز قابل للحرارة تم الحصول عليه من الكائن الدقيق المحب للحرارة Thermus Thermophilus ، والذي يعرض نشاط النسخ في وجود Mn 2+ ، باعتباره نسخة عكسية. إنه الإنزيم الوحيد المعروف القادر على إظهار نشاط البوليميراز والنسخ.

لتنفيذ تفاعل النسخ العكسي في خليط التفاعل ، وكذلك في تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يجب أن تكون البادئات موجودة كطبقة أولية ومزيج من 4 dNTP كمواد بناء.

بعد تفاعل النسخ العكسي ، يمكن لجزيئات cDNA الناتجة أن تكون هدفًا لـ PCR.

5. تنظيم العملية التكنولوجية لإنشاء PCR

إن الحساسية العالية المحتملة لتفاعل البلمرة المتسلسل تجعل تصميم مختبر PCR دقيقًا بشكل خاص أمرًا ضروريًا. هذا يرجع إلى المشكلة الأكثر حدة في الطريقة - التلوث.

التلوث - الانتقال من البيئة الخارجية إلى خليط تفاعل جزيئات DNA معينة يمكن أن تكون بمثابة أهداف في تفاعل التضخيم وتعطي نتائج إيجابية خاطئة.

هناك عدة طرق للتعامل مع هذه الظاهرة غير السارة. واحد منهم هو استخدام إنزيم N-uracil-glycosylase (UG). تعتمد هذه الطريقة على قدرة UG على شق جزيئات الحمض النووي باستخدام اليوراسيل المضمن. يتم إجراء تفاعل التضخيم باستخدام خليط dNTP ، حيث يتم استبدال dTTP بـ uracil ، وبعد التدوير الحراري ، ستحتوي جميع الأمبليكون المتكونة في أنبوب الاختبار على اليوراسيل. إذا تمت إضافة UG إلى خليط التفاعل قبل التضخيم ، فسيتم تدمير الأمبليكون في خليط التفاعل ، بينما سيظل الحمض النووي الأصلي سليمًا وسيعمل أيضًا كهدف للتضخيم.

وبالتالي ، فإن هذه الطريقة تقضي إلى حد ما فقط على مصدر التلوث ولا تضمن عدم وجود نتائج إيجابية خاطئة.

هناك طريقة أخرى للتعامل مع نتائج التلوث وهي التقليل بشكل كبير من عدد دورات التفاعل (حتى 25-30 دورة). ولكن حتى مع هذا النهج ، فإن خطر الحصول على نتائج إيجابية خاطئة مرتفع ، لأنه في هذه الحالة ، في حالة عدم وجود مثبطات ، من السهل الحصول على منتج تضخيم بسبب التلوث.

وهكذا ، على الرغم من فوائد تدابير التضخيم المسبق التي تهدف إلى تعطيل جزيئات الحمض النووي التي تتسبب في نتائج إيجابية خاطئة ، فإن أكثر الوسائل جذرية هي منظمة مخبرية مدروسة جيدًا.

استنتاج

يتم حاليًا تلقي أكثر طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل انتشارًا كوسيلة لتشخيص الأمراض المعدية المختلفة. يسمح لك تفاعل البوليميراز المتسلسل بتحديد مسببات العدوى ، حتى لو كانت العينة المأخوذة للتحليل تحتوي فقط على عدد قليل من جزيئات الحمض النووي لمسببات الأمراض. يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل على نطاق واسع في التشخيص المبكر لعدوى فيروس العوز المناعي البشري والتهاب الكبد الفيروسي ، إلخ. اليوم ، لا يوجد عامل معدي تقريبًا لا يمكن اكتشافه باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل.