واکنش های هماگلوتیناسیون غیر مستقیم یا غیرفعال. واکنش هماگلوتیناسیون واکنش هماگلوتیناسیون معکوس است

این واکنش برای شناسایی آنتی ژن های پاتوژن ها در ماده آزمایشی با افزودن سرم ایمنی به آن انجام می شود. در حضور یک آنتی ژن همولوگ، اتصال آنتی بادی ها اتفاق می افتد، بنابراین، پس از افزودن گلبول های قرمز حساس شده با یک آنتی ژن، آگلوتیناسیون آنها اتفاق نمی افتد، که به عنوان یک نتیجه مثبت ارزیابی می شود. برای حساسیت بیشتر واکنش، یک سرم ایمنی خاص در حداقل مقدار (2 واحد هماگلوتینه) به ماده آزمایش اضافه می شود. تیتر سرم ایمنی قبلاً با استفاده از RNGA تعیین می شود. برای یک واحد هماگلوتینه کننده، رقت محدود سرم گرفته می شود که باعث چسبندگی گلبول های قرمز می شود.

روش شناسی. در چاه های صفحات پلی استایرن یا لوله های آگلوتیناسیون 0.025 میلی لیتر از محلول 1٪ سرم خرگوش معمولی اضافه کنید و رقت های 2 برابری از مواد آزمایش را انجام دهید. سپس 0.025 میلی لیتر سرم ایمنی به تمام چاهک ها اضافه می شود، پلیت تکان داده می شود و به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد یا به مدت 1 ساعت در دمای اتاق قرار می گیرد. سپس 0.025 میلی‌لیتر آنتی‌ژن تشخیصی به همه چاهک‌ها اضافه می‌شود و تکان داده می‌شود و به مدت 2 ساعت باقی می‌ماند و پس از آن نتایج در نظر گرفته می‌شود.

هنگام انجام این واکنش، کنترل ویژگی سرم ایمنی به کنترل RNGA اضافه می شود که شامل یک آنتی ژن خاص، سرم ایمنی (2، 1، 0.5 واحد هماگلوتینه) و سوسپانسیون گلبول های قرمز حساس شده است.

RTNGA همچنین برای تشخیص آنتی بادی های خاص (کامل و مسدود کننده) استفاده می شود که برای آن مقدار دوز آنتی ژن به سرم آزمایش اضافه می شود. اگر حاوی آنتی بادی باشد، آنها توسط آنتی ژن متصل می شوند، بنابراین، پس از افزودن گلبول های قرمز حساس شده با آنتی بادی ها (مرحله دوم RTNGA)، گلبول های قرمز به هم نمی چسبند.

به دلیل استفاده از حداقل مقدار آنتی ژن (2 دوز خنثی کننده)، واکنش بسیار حساس است. تعداد دوزهای خنثی کننده در آماده سازی آنتی ژنی با استفاده از RNGA تعیین می شود، در حالی که رقت های سریالی 2 برابری آنتی ژن در محلول 1٪ سرم خرگوش معمولی ساخته می شود و یک آنتی بادی erythrocyte diagnosticum وارد چاهک ها می شود. دوز خنثی کننده آنتی ژن حداکثر رقت آن در نظر گرفته می شود که باعث چسبندگی کامل گلبول های قرمز حساس می شود.

قبل از واکنش، سرم های آزمایش شده 1: 5-1: 10 رقیق شده و در دمای 56 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه غیرفعال می شوند. برای جذب هماگلوتینین ها، یک سوسپانسیون 50 درصد از گلبول های قرمز فرمالین شده یا تازه شسته شده قوچ به میزان 0.1 میلی لیتر سوسپانسیون در هر 1 میلی لیتر سرم رقیق شده به سرم اضافه می شود. مخلوط تکان داده می شود و به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد یا 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه می شود و پس از آن گلبول های قرمز با سانتریفیوژ رسوب می کنند. می توانید تا روز بعد سرم را در یخچال بگذارید تا گلبول های قرمز رسوب کند.

در طول آزمایش، مواد مورد آزمایش در محلول 1٪ سرم خرگوش معمولی در حجم 0.025 میلی لیتر در چاهک های پانل میکروتیتر رقیق می شود. سپس 2 دوز خنثی کننده آنتی ژن در حجم 0.025 میلی لیتر به هر چاهک اضافه می شود. صفحات را تکان داده و به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد یا به مدت 1 ساعت در دمای اتاق قرار می دهند. سپس 0.025 میلی لیتر آنتی بادی erythrocyte diagnosticum به همه چاهک ها اضافه می شود. صفحات تکان داده می شوند و به مدت 1.5-2 ساعت در دمای اتاق انکوبه می شوند و پس از آن نتایج واکنش در نظر گرفته می شود. حسابداری روز بعد نیز قابل انجام است. تیتر سرم آزمایش حداکثر رقت آن در نظر گرفته می شود که در آن هیچ چسبندگی گلبول های قرمز وجود ندارد.

تجربه با انواع کنترل های زیر همراه است:

1) ثبات گلبول های قرمز حساس (گلبول های قرمز + 1٪ محلول سرم خرگوش طبیعی).

2) کامل بودن کاهش هماگلوتینین در هر سرم آزمایشی (سرم آزمایش در کمترین رقت + گلبول های قرمز رسمی)؛

3) صحت تعیین حداقل دوز خنثی کننده آنتی ژن (2، 1 و 0.5 دوز خنثی کننده آنتی ژن + آنتی بادی erythrocyte diagnosticum).

واکنش بازخورد هماگلوتیناسیون غیر مستقیم(ronga) برای نشان دادن آنتی ژن های باکتریایی و ویروسی در مواد آزمایشی و همچنین برای تشخیص سریع تعدادی از عفونت ها استفاده می شود.

برخلاف RNGA، در این واکنش، گلبول‌های قرمز نه با آنتی ژن، بلکه با آنتی‌بادی‌هایی حساس می‌شوند که با افزودن آنتی‌ژن، آگلوتیناسیون آن‌ها اتفاق می‌افتد.

گلبول های قرمز ابتدا با فرمالین یا گلوتارآلدئید تثبیت می شوند و سپس با گاما گلوبولین که از سرم های ایمنی جدا شده و از سایر پروتئین های سرم خالص می شود، متصل می شوند. اتصال گاما گلوبولین به سطح گلبول های قرمز با کمک کروم کلرید اتفاق می افتد. برای این کار، 1 حجم ایمونوگلوبولین های جدا شده از سرم ایمنی، 1 حجم سوسپانسیون 50 درصد گلبول های قرمز فرمالیزه و 1 حجم محلول 0.1-0.2 درصد کلرید کروم به 8 حجم آب مقطر اضافه می شود. مخلوط به مدت 10-15 دقیقه در دمای اتاق باقی می ماند، سپس گلبول های قرمز مانند یک واکنش هماگلوتیناسیون غیرفعال درمان می شوند.

ویژگی آنتی بادی تشخیصی در واکنش مهار هماگلوتیناسیون غیرفعال توسط یک آنتی ژن همولوگ بررسی می شود. واکنش باید توسط یک آنتی ژن همولوگ حداقل 16 بار مهار شود و توسط یک آنتی ژن هترولوگ مهار نشود. کنترل برای عدم وجود هماگلوتیناسیون خود به خودی استفاده می شود.

با کمک این واکنش، نشانه ای از عوامل بیماری زا در مواد گرفته شده از اندام های افراد مرده و حیوانات، به عنوان مثال، از مغز، طحال، کبد ریه ها انجام می شود. سوسپانسیون 10 درصدی از این اندام ها را روی محلول کلرید سدیم ایزوتونیک تهیه کنید، آنها را به مدت 30-60 دقیقه با سرعت 10000 دور در دقیقه سانتریفیوژ کنید و از مایع رویی به عنوان آنتی ژن استفاده کنید.

روش شناسی.رقت های 2 برابری از مواد مورد آزمایش (آنتی ژن) را در محلول تثبیت کننده آماده کنید. 1 قطره از هر رقت آنتی ژن را به 3 چاه مجاور میکروپانل اضافه کنید (واکنش به 3 ردیف چاهک موازی نیاز دارد). به هر چاهک ردیف اول 1 قطره محلول تثبیت کننده، 1 قطره سرم ایمنی همولوگ با رقت 1:10 به چاهک های ردیف دوم، 1 قطره سرم ایمنی هترولوگ در ردیف سوم اضافه کنید. ردیف های دوم و سوم به عنوان کنترل هایی برای ویژگی پاسخ عمل می کنند. مخلوط به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق باقی می ماند.

به تمام چاهک ها 1 قطره از سوسپانسیون 1% گلبول های قرمز حساس (آنتی بادی گلبول قرمز تشخیصی) اضافه کنید و صفحات را کاملا تکان دهید. نتایج واکنش پس از 30-40 دقیقه در نظر گرفته می شود. در حضور یک آنتی ژن خاص، هماگلوتیناسیون در ردیف اول و سوم (با سرم هترولوگ) مشخص می شود و در ردیف دوم وجود ندارد، جایی که آنتی ژن قبلا با سرم همولوگ خنثی شده است.

این واکنش با کنترل گلبول های قرمز حساس برای آگلوتیناسیون خود به خود همراه است.

واکنش مهار هماگلوتیناسیون غیر مستقیم معکوس (RTONGA)به شما امکان می دهد وجود آنتی بادی ها را در سرم انسان و حیوانات تعیین کنید.

روش شناسی. سرم ها 10 بار با محلول کلرید سدیم ایزوتونیک رقیق می شوند و به مدت 20 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی گراد حرارت داده می شود تا مهارکننده های غیر اختصاصی از بین بروند و سپس رقت های 2 برابری از سرم ها در محلول تثبیت کننده و دوز کاری آنتی ژن حاوی 4 واحد آگلوتینه کننده تهیه می شوند. 1 قطره از هر رقت سرم را به چاهک های میکروپنل اضافه کنید و 1 قطره آنتی ژن به آنها اضافه کنید که رقت آن مطابق با دوز کاری است. پس از تماس اجزای مخلوط به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق، 1 قطره آنتی بادی گلبول قرمز تشخیصی به همه چاهک ها اضافه شده و کاملا تکان داده می شود. پس از 1.5-2 ساعت انکوباسیون در دمای اتاق، نتایج واکنش با هماگلوتیناسیون در نظر گرفته می شود. تیتر سرم بالاترین رقت آن است که واکنش هماگلوتیناسیون را با چهار واحد آنتی ژن آگلوتیناسیون کاملاً مهار می کند.

واکنش با کنترل گلبول های قرمز حساس برای آگلوتیناسیون خود به خود در حضور: الف) محلول تثبیت کننده همراه است. ب) آنتی ژن طبیعی (از موادی که حاوی ویروس نیستند). ج) سرم آزمایش مزیت واکنش در تطبیق پذیری آن و امکان استفاده از آن برای تشخیص آنتی ژن های مختلف است.

ارزیابی نتایج هماگلوتیناسیون. نتایج RNGA، RONGA و RTONGA با توجه به درجه آگلوتیناسیون گلبول های قرمز در نظر گرفته می شود: (++++) - آگلوتیناسیون کامل. (+++) - آگلوتیناسیون کامل کمتر؛ (++) - آگلوتیناسیون جزئی؛ (+) - آثار آگلوتیناسیون؛ (-) - بدون آگلوتیناسیون.

اگر آگلوتیناسیون کامل (++++) یا تقریباً کامل (+++) باشد، واکنش مثبت در نظر گرفته می‌شود، روش تشخیصی در حضور هر یک از اجزای واکنش، آگلوتیناسیون خود به خود را نشان نمی‌دهد و کنترل ویژگی آنتی ژن یا آنتی بادی مثبت است.

واکنش هماگلوتیناسیون غیرمستقیم (غیرفعال) (RNGA) بر این واقعیت استوار است که گلبول های قرمز، اگر یک آنتی ژن محلول روی سطح آنها جذب شود، در هنگام تعامل با آنتی بادی های آنتی ژن جذب شده، توانایی آگلوتیناسیون را به دست می آورند. نمودار RNGA در شکل نشان داده شده است. 34. RNGA به طور گسترده در تشخیص تعدادی از عفونت ها استفاده می شود.

برنج. 34. طرح واکنش هماگلوتیناسیون غیرفعال (RPHA). الف - بدست آوردن اریتروسیت تشخیصی: B - RPHA: 1 - گلبول قرمز: 2 - آنتی ژن مورد مطالعه. 3 - erythrocyte diagnosticum; 4- آنتی بادی برای آنتی ژن مورد مطالعه: 5- آگلوتینه

بیانیه واکنش سرم آزمایش به مدت 30 دقیقه در دمای 56 درجه سانتیگراد حرارت داده می شود، به طور متوالی به نسبت 1:10 - 1:1280 رقیق می شود و در لوله ها یا چاه های 0.25 میلی لیتری ریخته می شود، سپس 2 قطره گلبول های قرمز تشخیصی (گلبول های قرمز با آنتی ژن جذب شده بر روی) اضافه می شود. آنها).

کنترل ها: تعلیق گلبول های قرمز تشخیصی با سرم ایمنی شناخته شده. تعلیق تشخیص با سرم طبیعی؛ تعلیق گلبول های قرمز طبیعی با سرم آزمایش شده. در کنترل اول آگلوتیناسیون باید اتفاق بیفتد، در کنترل دوم و سوم نباید باشد.

با کمک RIGA، اگر آنتی بادی های شناخته شده روی گلبول های قرمز جذب شوند، می توان یک آنتی ژن ناشناخته را تعیین کرد.

واکنش هماگلوتیناسیون را می توان در حجم 0.025 میلی لیتر (میکرو روش) با استفاده از میکروتیتر تاکاچی تنظیم کرد.

کنترل سوالات

1. نتیجه RHA مثبت بین گلبول های قرمز و مواد آزمایش شده برای وجود ویروس چه چیزی را نشان می دهد؟

2. آیا در صورت افزودن ویروس و سرم مربوطه به گلبول های قرمز، آگلوتیناسیون گلبول های قرمز اتفاق می افتد؟ نام واکنشی که این پدیده را آشکار می کند چیست؟

ورزش

نتیجه RIGA را در نظر بگیرید و ثبت کنید.

واکنش بارش

در واکنش رسوبی، یک کمپلکس ایمنی خاص، متشکل از یک آنتی ژن محلول (لیز، عصاره، هاپتن) و یک آنتی بادی خاص در حضور الکترولیت ها رسوب می کند.

حلقه یا رسوب ابری حاصل را رسوب می نامند. از واکنش آگلوتیناسیون، این واکنش عمدتاً در اندازه ذرات آنتی ژن متفاوت است.

واکنش بارش معمولاً برای تعیین آنتی ژن در تشخیص تعدادی از عفونت ها (سیاه زخم، مننژیت و غیره) استفاده می شود. در پزشکی قانونی - برای تعیین گونه های خون، اسپرم و غیره؛ در تحقیقات بهداشتی و بهداشتی - هنگام ایجاد جعل محصولات؛ با کمک آن، رابطه فیلوژنتیکی حیوانات و گیاهان مشخص می شود. برای واکنش شما نیاز دارید:

1. آنتی بادی ها (رسپیتین ها) - سرم ایمنی با تیتر بالایی از آنتی بادی ها (نه کمتر از 1: 100000). تیتر سرم رسوب با بالاترین رقت آنتی ژنی که با آن واکنش نشان می دهد تعیین می شود. سرم معمولاً رقیق نشده یا با رقت 1: 5 - 1:10 استفاده می شود.

2. آنتی ژن - املاح با طبیعت پروتئینی یا لیپوئیدی-پلی ساکاریدی (آنتی ژن ها و هاپتن های کامل).

3. محلول ایزوتونیک.

روش های اصلی انجام واکنش رسوب، واکنش رسوب حلقه ای و واکنش رسوب در آگار (ژل) است.

توجه! تمام اجزای دخیل در واکنش بارش باید کاملا شفاف باشند.

واکنش بارش حلقه ای... 0.2-0.3 میلی لیتر (5-6 قطره) سرم با استفاده از پیپت پاستور به لوله رسوب اضافه می شود (سرم نباید روی دیواره های لوله بیفتد). آنتی ژن به دقت روی سرم در همان حجم قرار می گیرد و آن را با یک پیپت نازک پاستور در امتداد دیواره لوله آزمایش می ریزند. در عین حال، لوله آزمایش در یک موقعیت شیبدار نگه داشته می شود. با لایه بندی مناسب، باید مرز مشخصی بین سرم و آنتی ژن ایجاد شود. لوله آزمایش را با احتیاط در یک قفسه قرار دهید تا مایعات با هم مخلوط نشوند. اگر واکنش مثبت باشد، یک "حلقه" کدر در مرز آنتی ژن و آنتی بادی - یک رسوب تشکیل می شود (شکل 48 را ببینید).

واکنش با تعدادی کنترل دنبال می شود (جدول 18). ترتیب اضافه کردن مواد واکنش به لوله آزمایش بسیار مهم است. قرار دادن سرم روی آنتی ژن غیرممکن است (در کنترل - روی محلول ایزوتونیک)، از آنجایی که چگالی نسبی سرم بیشتر است، به انتهای لوله آزمایش فرو می رود و مرز بین مایعات نخواهد بود. آشکار شود.

جدول 18. طرح مرحله بندی واکنش بارش حلقه

توجه داشته باشید. + وجود "حلقه"؛ - عدم وجود "حلقه".

نتایج پس از 5-30 دقیقه، در برخی موارد پس از یک ساعت، مانند همیشه، با شروع از کنترل ثبت می شود. "حلقه" در لوله آزمایش 2 نشان دهنده توانایی سرم ایمنی برای وارد شدن به یک واکنش خاص با آنتی ژن مربوطه است. در لوله های آزمایش 3-5 نباید "حلقه" وجود داشته باشد - هیچ آنتی بادی و آنتی ژن مربوطه وجود ندارد. یک "حلقه" در اولین لوله آزمایش - یک نتیجه مثبت از واکنش - نشان می دهد که آنتی ژن آزمایش شده با سرم ایمنی گرفته شده مطابقت دارد، عدم وجود "حلقه" (حلقه فقط در لوله آزمایش دوم) نشان دهنده آنها است. اختلاف - یک نتیجه منفی از واکنش.

واکنش رسوب آگار (ژل).... ویژگی واکنش این است که تعامل آنتی ژن و آنتی بادی در یک محیط متراکم، یعنی در یک ژل رخ می دهد. رسوب به دست آمده یک نوار کدر در قسمت عمده محیط ایجاد می کند. عدم وجود نوار نشان دهنده عدم تطابق بین اجزای واکنش است. این واکنش به طور گسترده در تحقیقات زیست پزشکی، به ویژه در مطالعه تشکیل سم در عامل ایجاد کننده دیفتری استفاده می شود.

کنترل سوالات

1. تفاوت اصلی بین واکنش های آگلوتیناسیون و رسوب چیست؟

2. چرا نمی توان از مواد کدر در واکنش بارش استفاده کرد؟

ورزش

1. واکنش بارش حلقه را تنظیم کنید و نتیجه را ترسیم کنید.

2. ماهیت برهمکنش آنتی ژن با آنتی بادی در واکنش رسوب در آگار را مطالعه کنید، نتیجه را ترسیم کنید (یک فنجان از معلم بگیرید).

واکنش لیز (سیتولیز ایمنی)

لیز ایمنی انحلال سلول ها تحت تأثیر آنتی بادی ها با مشارکت اجباری مکمل است. برای واکنش شما نیاز دارید:

1. آنتی ژن - میکروب ها، گلبول های قرمز یا سایر سلول ها.

2. آنتی بادی (لیزین) - سرم ایمنی، کمتر سرم بیمار. سرم باکتریولیتیک حاوی آنتی بادی هایی است که در لیز باکتری ها نقش دارند. همولیتیک - همولیزین ها که باعث لیز گلبول های قرمز می شوند. برای لیز اسپیروکت ها، اسپیروکتولیزین ها، سلول ها - ایتولیزین ها و غیره مورد نیاز هستند.

3. مکمل. بیشتر مکمل در سرم خوکچه هندی است. این سرم (مخلوطی از چندین حیوان) معمولاً به عنوان مکمل استفاده می شود. مکمل تازه (بومی) ناپایدار است و به راحتی با حرارت دادن، تکان دادن، ذخیره سازی از بین می رود، بنابراین نمی توانید آن را بیش از دو روز پس از دریافت استفاده کنید. برای حفظ مکمل، 2% اسید بوریک و 3% سولفات سدیم به آن اضافه می شود. این مکمل را می توان تا دو هفته در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری کرد. مکمل خشک اغلب استفاده می شود. قبل از استفاده، آن را در محلول ایزوتونیک به حجم اصلی (که روی برچسب نشان داده شده است) حل می کنند.

4. محلول ایزوتونیک.

واکنش همولیز(جدول 19). برای واکنش شما نیاز دارید:

1. آنتی ژن - 3% سوسپانسیون گلبول های قرمز شسته شده قوچ به میزان 0.3 میلی لیتر رسوب گلبول قرمز و 9.7 میلی لیتر محلول ایزوتونیک.

2. آنتی بادی - سرم همولیتیک (همولیزین) علیه گلبول های قرمز گوسفند. معمولاً در مرحله تولید تهیه می شود، لیوفیلیز می شود و تیتر آن روی برچسب مشخص می شود.

تیتر همولیزین بالاترین رقت سرمی است که در آن همولیز کامل سوسپانسیون 3 درصد گلبول های قرمز در حضور کمپلمان رخ می دهد. برای واکنش همولیز، همولیزین در تیتر سه گانه گرفته می شود، یعنی 3 برابر کمتر از قبل از تیتر رقیق می شود. به عنوان مثال، با تیتر سرم 1: 1200، سرم 1: 400 (0.1 میلی لیتر سرم * و 39.9 میلی لیتر محلول ایزوتونیک) رقیق می شود. همولیزین بیش از حد ضروری است، زیرا مقداری از آن می تواند توسط سایر اجزای واکنش جذب شود.

* (کمتر از 0.1 میلی لیتر سرم مصرف نکنید - دقت اندازه گیری آسیب می بیند.)

3. مکمل 1:10 (0.2 میلی لیتر مکمل و 1.8 میلی لیتر محلول ایزوتونیک) رقیق می شود.

4. محلول ایزوتونیک.

جدول 19. طرح واکنش همولیز

حسابداری برای نتایج اگر واکنش به درستی تنظیم شود، همولیز در اولین لوله آزمایش رخ می دهد - محتویات آن شفاف می شود. در کنترل ها، مایع کدر می ماند: در لوله آزمایش 2 برای شروع همولیز، مکمل وجود ندارد، در 3 - همولیزین وجود ندارد، در 4 - نه همولیزین وجود دارد و نه مکمل، در 5 - آنتی ژن با آنتی بادی مطابقت ندارد،

در صورت لزوم، سرم همولیتیک طبق طرح زیر تیتر می شود (جدول 20).

قبل از تیتراسیون، رقت اولیه سرم 1: 100 (0.1 میلی لیتر سرم و 9.9 میلی لیتر محلول ایزوتونیک) را تهیه کنید، که از آن رقت های لازم به عنوان مثال:

از این رقت ها، همانطور که در جدول نشان داده شده است، 0.5 میلی لیتر سرم به لوله های آزمایش آزمایش تیتراسیون اضافه می شود. بیست.

جدول 20. طرح تیتراسیون سرم همولیتیک (همولیزین)

در مثال نشان داده شده در جدول. 20، تیتر سرم همولیتیک 1: 1200 است.

هنگام استفاده از سرم همولیتیک تازه، باید آن را غیرفعال کرد تا مکمل موجود در آن از بین برود. برای انجام این کار، به مدت 30 دقیقه در دمای 56 درجه سانتیگراد در یک حمام آب یا در یک غیرفعال کننده با ترموستات گرم می شود. روش آخر بهتر است: احتمال گرم شدن بیش از حد آب پنیر، یعنی دناتوره شدن آن را حذف می کند. سرم های دناتوره شده برای آزمایش مناسب نیستند.

واکنش باکتریولیز... در این واکنش، کمپلمان باکتری ها را در حضور سرم مناسب (همولوگ) لیز می کند. طرح واکنش اساساً شبیه طرح واکنش همولیز است. با این تفاوت که پس از انکوباسیون دو ساعته، همه لوله‌ها روی ظروف پتری با محیطی مناسب برای میکروارگانیسم‌های وارد شده در آزمایش تلقیح می‌شوند تا مشخص شود آیا لیز شده است یا خیر. با یک آزمایش درست تنظیم شده، تلقیح از 2-5 لوله (شاهد) باید رشد فراوان داشته باشد. عدم رشد یا رشد ضعیف در تلقیح از لوله آزمایش 1 (آزمایش) نشان دهنده مرگ میکروب ها است، یعنی همولوگ بودن آنها با آنتی بادی.

توجه! واکنش باکتریولیز باید در شرایط آسپتیک انجام شود.

کنترل سوالات

1. اگر به جای محلول ایزوتونیک کلرید سدیم از آب مقطر استفاده شود چه اتفاقی برای گلبول های قرمز می افتد؟ پشت این پدیده چیست؟

2. وقتی گلبول های قرمز با سرم ایمنی همولوگ در غیاب کمپلمان برهم کنش می کنند چه واکنشی رخ خواهد داد؟

ورزش

یک واکنش همولیز تنظیم کنید. نتیجه را بگیرید و ترسیم کنید.

اطلاعات مشابه

تشخیص آزمایشگاهی تقریباً همه بیماری های عفونیاین بر اساس تشخیص آنتی بادی های موجود در خون بیمار است که بر علیه آنتی ژن های پاتوژن با روش های واکنش های سرولوژیکی تولید می شود. آنها از اواخر قرن نوزدهم - اوایل قرن بیستم وارد عمل پزشکی شدند.

پیشرفت علم به تعیین ساختار آنتی ژنی میکروب ها و فرمول های شیمیایی سموم آنها کمک کرده است. این امکان ایجاد نه تنها سرم های درمانی، بلکه تشخیصی را نیز فراهم کرد. آنها با معرفی پاتوژن های ضعیف شده به حیوانات آزمایشگاهی به دست می آیند. پس از چند روز قرار گرفتن در معرض، از خون خرگوش یا موش آماده سازی تهیه می شود که برای شناسایی میکروب ها یا سموم آنها با استفاده از آزمایشات سرولوژیکی استفاده می شود.

تظاهرات خارجی چنین واکنشی به شرایط تنظیم آن و وضعیت آنتی ژن ها در خون بیمار بستگی دارد. اگر ذرات میکروبی نامحلول باشند، در سرم رسوب می‌کنند، لیز می‌شوند، متصل می‌شوند یا بی‌حرکت می‌شوند. اگر آنتی ژن ها محلول باشند، پدیده خنثی سازی یا رسوب آشکار می شود.

تست آگلوتیناسیون (RA)

واکنش آگلوتیناسیون سرولوژیکی بسیار اختصاصی است. از نظر اجرا ساده و به اندازه کافی واضح است تا به سرعت وجود آنتی ژن در سرم خون بیمار را مشخص کند. برای مرحله بندی واکنش ویدال (تشخیص حصبه و پاراتیفوئید) و ویگل (تیفوس) استفاده می شود.

این بر اساس یک تعامل خاص بین آنتی بادی های انسانی (یا آگلوتینین ها) و سلول های میکروبی (آگلوتینوژن ها) است. پس از برهم کنش آنها ذراتی تشکیل می شوند که رسوب می کنند. این یک نشانه مثبت است. برای مرحله‌بندی واکنش، می‌توان از عوامل میکروبی زنده یا کشته شده، قارچ‌ها، تک یاخته‌ها و سلول‌های سوماتیک استفاده کرد.

این واکنش از نظر شیمیایی به دو مرحله تقسیم می شود:

1. ارتباط اختصاصی آنتی بادی ها (AT) با آنتی ژن ها (AG).
2. غیر اختصاصی - بارش کنگلومراهای AG-AT، یعنی تشکیل آگلوتینات.

واکنش آگلوتیناسیون غیر مستقیم (RPHA)

برای تنظیم آن، از گلبول های قرمز خالص بره و گلبول های قرمز انسان استفاده می شود که با آنتی بادی ها یا آنتی ژن ها پیش درمان شده اند (این بستگی به این دارد که دستیار آزمایشگاه دقیقاً چه چیزی می خواهد پیدا کند). در برخی موارد، گلبول‌های قرمز خون انسان با ایمونوگلوبولین‌ها درمان می‌شوند. واکنش های سرولوژیکی گلبول های قرمز در صورتی معتبر تلقی می شوند که در انتهای لوله رسوب کنند. هنگامی که سلول ها به شکل یک چتر معکوس قرار می گیرند و کل قسمت پایین را اشغال می کنند، می توان یک واکنش مثبت گفت. اگر گلبول های قرمز خون در یک ستون یا به شکل یک دکمه در مرکز پایین قرار گرفته باشند، یک واکنش منفی شمارش می شود.

واکنش بارش (RP)

تست های سرولوژیکی از این نوع برای تشخیص ذرات بسیار کوچک آنتی ژن ها عمل می کنند. اینها می توانند، برای مثال، پروتئین ها (یا قسمت های آنها)، ترکیبات پروتئین ها با لیپیدها یا کربوهیدرات ها، بخش هایی از باکتری ها، سموم آنها باشند.

سرم برای واکنش با عفونت مصنوعی حیوانات، معمولاً خرگوش، به دست می آید. از این روش می توان برای بدست آوردن مطلقاً هر سرم رسوب دهنده استفاده کرد. تنظیم واکنش های رسوب سرولوژیکی از نظر مکانیسم اثر مشابه واکنش های آگلوتیناسیون است. آنتی‌بادی‌های سرم با آنتی‌ژن‌ها ترکیب می‌شوند و مولکول‌های پروتئینی بزرگی را تشکیل می‌دهند که در کف لوله یا روی یک بستر (ژل) رسوب می‌کنند. این روش بسیار خاص در نظر گرفته می شود و می تواند حتی مقادیر ناچیزی از یک ماده را تشخیص دهد.

برای تشخیص طاعون، تولارمی، سیاه زخم، مننژیت و سایر بیماری ها استفاده می شود. علاوه بر این، او درگیر معاینه پزشکی قانونی است.

در ژل

آزمایشات سرولوژیکی را می توان نه تنها در یک محیط مایع، بلکه در ژل آگار نیز انجام داد. به این روش بارش پراکنده می گویند. با کمک آن، ترکیب مخلوط های آنتی ژنی پیچیده مورد مطالعه قرار می گیرد. این روش بر اساس کموتاکسی آنتی ژن ها به آنتی بادی ها و بالعکس است. در ژل، آنها با سرعت های مختلف به سمت یکدیگر حرکت می کنند و در برخورد، خطوط بارش را تشکیل می دهند. هر خط - یک مجموعه AG-AT.

واکنش خنثی سازی اگزوتوکسین با آنتی توکسین (RN)

سرم های آنتی توکسیک می توانند اثر اگزوتوکسین تولید شده توسط میکروارگانیسم ها را خنثی کنند. این واکنش های سرولوژیکی بر این اساس است. میکروبیولوژی از این روش برای تیتراسیون سرم ها، سموم و سموم و همچنین تعیین فعالیت درمانی آنها استفاده می کند. قدرت خنثی سازی سم توسط واحدهای معمولی - AE تعیین می شود.

علاوه بر این، به لطف این واکنش، می توان گونه یا نوع اگزوتوکسین را تعیین کرد. برای دیفتری، بوتولیسم استفاده می شود. مطالعه را می توان هم "روی شیشه" و هم در ژل انجام داد.

واکنش لیز (RL)

سرم ایمنی که وارد بدن بیمار می شود، علاوه بر عملکرد اصلی خود یعنی ایمنی غیرفعال، دارای خاصیت لیز نیز می باشد. قادر است عوامل میکروبی، عناصر خارجی سلولی و ویروس های وارد شده به بدن بیمار را حل کند. بسته به ویژگی آنتی بادی های موجود در سرم، باکتریولیزین ها، سیتولیزین ها، اسپیروکتولیزین ها، همولیزین ها و سایرین جدا می شوند.

این آنتی بادی های خاص مکمل نامیده می شوند. تقریباً در تمام مایعات بدن یافت می شود، ساختار پروتئینی پیچیده ای دارد و به افزایش دما، لرزش، اسیدها و نور مستقیم خورشید بسیار حساس است. اما در حالت خشک شده قادر است تا شش ماه خاصیت لیتیک خود را حفظ کند.

انواع چنین واکنش های سرولوژیکی از این نوع وجود دارد:

باکتریولیز؛

همولیز.

باکتریولیز با استفاده از سرم خون بیمار و سرم ایمنی اختصاصی با میکروب های زنده انجام می شود. اگر مقدار کافی مکمل در خون وجود داشته باشد، محقق شاهد لیز باکتری ها خواهد بود و واکنش مثبت تلقی می شود.

دومین واکنش سرولوژیکی خون این است که سوسپانسیون گلبول های قرمز بیمار با سرم حاوی همولیزین درمان می شود که فقط در حضور یک تعارف خاص فعال می شود. اگر یکی وجود داشته باشد، دستیار آزمایشگاه انحلال گلبول های قرمز را مشاهده می کند. این واکنش به طور گسترده ای در پزشکی مدرنبرای تعیین تیتر کمپلمان (یعنی کمترین مقداری که باعث لیز گلبول های قرمز خون می شود) در سرم خون و راه اندازی یک سنجش اتصال مکمل. به این ترتیب است که یک واکنش سرولوژیکی برای سیفلیس انجام می شود -

واکنش تثبیت کمپلمان (CBC)

این واکنش برای شناسایی آنتی بادی های یک عامل عفونی در سرم خون بیمار و همچنین شناسایی پاتوژن با ساختار آنتی ژنی آن استفاده می شود.

تا این مرحله واکنش های ساده سرولوژیکی را شرح داده ایم. CSC یک واکنش پیچیده در نظر گرفته می شود، زیرا نه دو، بلکه سه عنصر در آن تعامل دارند: آنتی بادی، آنتی ژن و مکمل. ماهیت آن در این واقعیت نهفته است که تعامل بین آنتی بادی و آنتی ژن فقط در حضور پروتئین های کامپلیمنت اتفاق می افتد که روی سطح مجتمع AG-AT تشکیل شده جذب می شوند.

خود آنتی ژن ها پس از افزودن مکمل، دستخوش تغییرات قابل توجهی می شوند که کیفیت واکنش انجام شده را نشان می دهد. این می تواند لیز، همولیز، بیحرکتی، باکتری کشی یا اثر باکتریواستاتیک باشد.

خود واکنش در دو مرحله رخ می دهد:

1. تشکیل کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی که از نظر بصری برای محقق قابل مشاهده نیست.
2. تغییر آنتی ژن تحت تأثیر مکمل. این مرحله اغلب با چشم غیر مسلح قابل ردیابی است. اگر واکنش به صورت بصری قابل مشاهده نباشد، از یک سیستم نشانگر اضافی برای شناسایی تغییرات استفاده می شود.

سیستم نشانگر

این واکنش مبتنی بر اتصال مکمل است. گلبول های قرمز خالص قوچ و سرم همولیتیک که حاوی مکمل نیست، یک ساعت پس از تنظیم RSC به لوله آزمایش اضافه می شود. اگر مکمل غیر متصل در لوله آزمایش باقی بماند، به کمپلکس AG-AT تشکیل شده بین سلول های خون بره و همولیزین می پیوندد و باعث حل شدن آنها می شود. این بدان معنی است که RSK منفی است. اگر گلبول های قرمز دست نخورده باقی بمانند، بر این اساس، واکنش مثبت است.

واکنش هماگلوتیناسیون (HA)

دو واکنش هماگلوتیناسیون اساساً متفاوت وجود دارد. یکی از آنها سرولوژیکی است که برای تعیین گروه های خونی استفاده می شود. در این مورد، گلبول های قرمز خون با آنتی بادی ها تعامل دارند.

و واکنش دوم برای سرولوژیک اعمال نمی شود، زیرا گلبول های قرمز خون با هماگلوتینین های تولید شده توسط ویروس ها واکنش می دهند. از آنجایی که هر پاتوژن فقط روی گلبول های قرمز خاص (مرغ، بره، میمون) عمل می کند، این واکنش را می توان بسیار خاص در نظر گرفت.

با قرار گرفتن گلبول های خونی در انتهای لوله آزمایش می توانید متوجه مثبت یا منفی بودن واکنش شوید. اگر الگوی آنها شبیه یک چتر معکوس باشد، ویروس مورد نظر در خون بیمار وجود دارد. و اگر همه گلبول های قرمز مانند یک ستون سکه تشکیل شده باشند، پس هیچ عامل بیماری زایی وجود ندارد.

واکنش مهار هماگلوتیناسیون (RTGA)

این یک واکنش بسیار خاص است که به شما امکان می دهد نوع، نوع ویروس یا وجود آنتی بادی های خاص در سرم خون بیمار را تعیین کنید.

ماهیت آن در این واقعیت نهفته است که آنتی بادی های اضافه شده به لوله آزمایش با مواد آزمایش از رسوب آنتی ژن ها روی گلبول های قرمز جلوگیری می کند و در نتیجه هماگلوتیناسیون را متوقف می کند. این یک نشانه کیفی از وجود آنتی ژن های خاص برای یک ویروس هدف خاص در خون است.

واکنش ایمونوفلورسانس (RIF)

این واکنش بر اساس توانایی تشخیص کمپلکس های AG-AT پس از درمان با رنگ های فلوروکروم است. استفاده از این روش آسان است، نیازی به جداسازی یک فرهنگ خالص ندارد و زمان کمی می برد. برای تشخیص سریع بیماری های عفونی ضروری است.

در عمل، این واکنش های سرولوژیکی به دو نوع مستقیم و غیر مستقیم تقسیم می شوند.

RIF مستقیم با آنتی ژنی تولید می شود که از قبل با سرم فلورسنت تیمار شده است. و به طور غیرمستقیم ابتدا با یک کیت تشخیصی مرسوم حاوی آنتی ژن آنتی بادی های مورد نظر درمان می شود و سپس سرم لومینسانس که مخصوص پروتئین های کمپلکس AG-AT است مجددا استفاده می شود و سلول های میکروبی در زیر میکروسکوپ قابل مشاهده می شوند.

جلسه 14

موضوع: واکنش های سرولوژیکی غیرمستقیم. واکنش های هماگلوتیناسیون غیرمستقیم (RNGA)، اتصال مکمل (RAC).

آنتی بادی ها

آنتی بادی ها مولکول های پروتئینی هستند که قادر به اتصال ویژه به آنتی ژن ها هستند. آنتی بادی ها به عنوان گاما گلوبولین شناخته می شوند. نام دیگر آنتی بادی ها ایمونوگلوبولین است. در پستانداران، 5 کلاس ایمونوگلوبولین وجود دارد که از نظر ساختار و برخی خواص متفاوت هستند: IgG، IgM، IgA، IgE، IgD.

ساختار ایمونوگلوبولین ها... IgG "معمولی ترین" ساختار را دارد. این مولکول از 4 زنجیره پروتئینی تشکیل شده است: دو زنجیره سبک (L) و دو زنجیره سنگین (H) که توسط پیوندهای دی سولفیدی به هم متصل هستند. محل آنتی بادی که به آنتی ژن متصل می شود، محل فعال آنتی بادی نامیده می شود. 2 مرکز فعال در مولکول IgG وجود دارد. این توسط بخش های N ترمینال زنجیره های سنگین و سبک تشکیل شده است. ناحیه زنجیرهای سنگین که در نزدیکی پیوندهای دی سولفید قرار دارد، ناحیه لولا نامیده می شود. با استفاده از آنزیم پاپائین، مولکول IgG در بالای ناحیه لولا به 3 قطعه تقسیم می شود: 2 قطعه شامل زنجیره سبک و بخشی از زنجیره سنگین (قطعات Fab). و قطعه سوم فقط از بخشی از زنجیره های سنگین (قطعه Fc) تشکیل شده است. به لطف ناحیه لولای متحرک، قطعات Fab می توانند موقعیت نسبی خود را در فضا تغییر دهند.

توالی آمینو اسیدهای زنجیره سبک و سنگین به دو ناحیه ثابت (ثابت) و متغیر تقسیم می شوند. مکان های متغیر در انتهای N زنجیره سبک و سنگین (VL و VH) یافت می شود. مکان های ثابت در انتهای C زنجیره ها (CL و CH) قرار دارند. در زنجیره های سبک و سنگین، توالی های اسید آمینه چندین ساختار کروی به نام دامنه را تشکیل می دهند.

مرکز فعال یک آنتی بادی توسط حوزه های متغیر زنجیره سبک و سنگین تشکیل شده و یک حفره است. پاراتوپ) که دارای پیکربندی و توزیع خاصی از بارهای الکتریکی در سطح خود است. اندازه، شکل و توزیع بارها در مرکز فعال، ویژگی آن را تعیین می کند، یعنی توانایی اتصال به یک تعیین کننده آنتی ژنی خاص. اپی توپ) داشتن ساختار مکمل.

عوامل تعیین کننده آنتی ژنیک مناطقی هستند که بر روی سطح مولکول های آنتی ژن بیرون زده اند. بنابراین، برهمکنش اپی توپ-پاراتوپ طبق اصل "قفل کلید" رخ می دهد.

استحکام باند مرکز فعال آنتی بادی ها با تعیین کننده آنتی ژنی با مفهوم میل مشخص می شود. قرابتمعیاری برای سنجش میل ترکیبی یک محل فعال و یک عامل تعیین کننده آنتی ژنی است.

ایمونوگلوبولین های کلاس IgG 75 درصد از کل مقدار ایمونوگلوبولین های سرم را تشکیل می دهند. یکی از ویژگی های مهم IgG توانایی آنها برای عبور از جفت است. بنابراین، آنتی بادی های مادر وارد بدن کودک می شود و از عفونت در ماه های اول زندگی محافظت می کند (ایمنی غیرفعال طبیعی).

حدود 10 درصد از کل مجموعه ایمونوگلوبولین ها متعلق به کلاس IgM است. یک مولکول IgM یک پنتامر است، یعنی از 5 مولکول یکسان تشکیل شده است، از نظر ساختار شبیه به یک مولکول IgG، دارای 10 مرکز فعال است. زیرواحدها توسط پیوندهای دی سولفیدی به هم متصل می شوند. مولکول IgM دارای یک زنجیره J اضافی است که به زیر واحدها متصل می شود. آنتی بادی های IgM از سد جفت عبور نمی کنند.

آنتی بادی های کلاس IgA 15-20٪ از کل محتوای ایمونوگلوبولین ها را تشکیل می دهند. مولکول IgA از 2 زنجیره سبک و 2 زنجیره سنگین تشکیل شده و دارای 2 مرکز فعال است. در سرم خون IgA به صورت مونومر وجود دارد، در حالی که در ترشحات مخاطی IgA به صورت دایمر ارائه می شود و به آنها ترشحی یا sIgA می گویند دارای 4 مرکز فعال هستند. انتهای C زنجیره های سنگین در مولکول sIgA توسط یک زنجیره J و یک مولکول پروتئینی به نام جزء ترشحی به هم متصل می شوند. جزء ترشحی از sIgA در برابر تخریب توسط آنزیم های پروتئولیتیک موجود در آن محافظت می کند تعداد زیادیدر راز غشاهای مخاطی عملکرد اصلی sIgA محافظت از غشاهای مخاطی در برابر عفونت است. IgA از سد جفت عبور نمی کند. غلظت بالایی از sIgA در شیر مادر به خصوص در روزهای اول شیردهی یافت می شود. محافظت می کنند دستگاه گوارشنوزاد از عفونت

IgD ها عمدتا بر روی غشای لنفوسیت های B یافت می شوند. آنها ساختاری مشابه IgG دارند، 2 مرکز فعال. نقش بیولوژیکی به طور کامل درک نشده است.

IgE - غلظت این دسته از ایمونوگلوبولین ها در سرم خون بسیار کم است. مولکول های IgE عمدتاً روی سطح ماست سل ها و بازوفیل ها ثابت می شوند. در ساختار خود، IgE مشابه IgG است، دارای 2 مرکز فعال است. فرض بر این است که IgE در ایجاد ایمنی انتهلمینتیک ضروری است. IgE نقش عمده‌ای در پاتوژنز برخی بیماری‌های آلرژیک (آسم برونش، تب یونجه) و شوک آنافیلاکتیک دارد.

واکنش هماگلوتیناسیون غیر مستقیم

در واکنش های سرولوژیکی غیرمستقیم، کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی با چشم غیرمسلح قابل مشاهده نیست. در چنین مواردی، آنتی‌ژن‌ها بر روی ذرات حامل بزرگ‌تر (گلبول‌های قرمز، ذرات لاتکس) جذب می‌شوند که منجر به تشخیص آنتی ژنی گلبول قرمز می‌شود. آگلوتیناسیون بعدی چنین ذرات با آنتی بادی های خاص باعث می شود که آگلوتینات (رسوب) با چشم غیر مسلح دیده شود. واکنش هماگلوتیناسیون غیرمستقیم (غیرفعال) (RNGA) آنتی‌بادی‌های سرم را با استفاده از یک گلبول قرمز تشخیصی آنتی‌ژنیک، که گلبول‌های قرمز با آنتی‌ژن‌های جذب شده روی آن‌ها هستند، شناسایی می‌کند.

گلبول های قرمز با آنتی ژن های جذب شده روی آنها با آنتی بادی های مربوطه سرم خون تعامل می کنند که باعث چسبندگی و ریزش گلبول های قرمز به ته لوله آزمایش یا سلول به شکل رسوب اسکالوپ می شود. در صورت واکنش منفی، گلبول های قرمز به صورت دکمه ای ته نشین می شوند.

RNGA در صفحات پلاستیکی یا در لوله های آزمایش با رقت های سرم خون قرار داده می شود که گلبول های قرمز تشخیصی به آن اضافه می شود.

گاهی اوقات از یک آنتی بادی erythrocyte diagnosticum استفاده می شود - گلبول های قرمز که روی آن آنتی بادی ها جذب می شوند. این واکنش RONGA نامیده می شود - واکنش هماگلوتیناسیون غیر مستقیم معکوس.

اجزای RNGA:

سرم خون بیمار (رقت 1:25)؛

اریتروسیت تشخیصی (گلبول های قرمز بارگیری شده با آنتی ژن پاتوژن مورد بررسی)؛

محلول شستشو.

تنظیم RNGA در هفت چاه صفحه برای مطالعات ایمونولوژیک، دو قطره محلول بافر فسفات اضافه کنید. دو قطره از سرم خون بیمار به سوراخ اول اضافه می شود و پس از آن 2 قطره از سوراخ اول به سوراخ دوم و از سوراخ دوم به سوم و ... منتقل می شود و 2 قطره از سوراخ ششم خارج می شود. در هر هفت سوراخ (6 مورد آزمایشی و 1 مورد شاهد) 2 قطره گلبول قرمز اضافه کنید. پس از هر عمل، لازم است پیپت را در محلول شستشو بشویید. صفحات به مدت 45 دقیقه در دمای اتاق قرار می گیرند و پس از آن نتایج در نظر گرفته می شود.

واکنش اتصال مکمل

واکنش اتصال کمپلمان به این صورت است که وقتی یک آنتی ژن با یک آنتی بادی ترکیب می شود، یک کمپلکس ایمنی تشکیل می شود که مکمل از طریق قطعه Fc آنتی بادی ها به آن متصل می شود. اگر کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی تشکیل نشود، مکمل آزاد می ماند. مکمل آزاد با افزودن یک سیستم همولیتیک متشکل از گلبول های قرمز گوسفند و آنتی بادی علیه آنها به مخلوط شناسایی می شود. یک واکنش مثبت عدم وجود همولیز در نتیجه اتصال مکمل به مجموعه آنتی ژن + آنتی بادی است. یک واکنش منفی وجود همولیز در نتیجه اتصال کمپلمان به مجموعه آنتی بادی گلبول قرمز + ضد گلبول قرمز است.

اجزای RSK:

سرم خون سالم؛

سرم خون بیمار (رقیق شده 1: 5)؛

جزء آنتی ژنیک واکنش یک پاتوژن غیرفعال است.

مکمل در رقت مربوط به دوز کاری. مکمل از سرم خون خوکچه هندی به دست می آید. تیتر کمپلمان حداقل دوز آن است که در حضور سرم همولیتیک باعث همولیز کامل گلبول های قرمز می شود. دوز کاری مکمل مورد استفاده در فرمولاسیون CSC 30% بیشتر از تیتر آن است.

سیستم همولیتیک - یک سوسپانسیون از گلبول های قرمز قوچ که با آنتی بادی های خرگوش به گلبول های قرمز قوچ درمان شده است.

محلول شستشو.

بیانیه RSK RSK در دو لوله آزمایش - آزمایشی و کنترل قرار می گیرد. 0.5 میلی لیتر از سرم خون بیمار به لوله آزمایش، 0.5 میلی لیتر از سرم خون اهدا کننده سالم به لوله کنترل، 0.5 میلی لیتر از لیزات پاتوژن به هر دو لوله آزمایش و همچنین 0.5 میلی لیتر از سرم خون بیمار اضافه می شود. متمم. پس از هر عمل، لازم است پیپت را در محلول شستشو بشویید. لوله ها به مدت 30 دقیقه در ترموستات با دمای 37 درجه سانتیگراد قرار می گیرند. پس از انکوباسیون، 1.0 میلی لیتر از سیستم همولیتیک به هر دو لوله اضافه می شود. لوله ها تکان داده می شوند و به مدت 30 دقیقه در یک ترموستات با دمای 37 درجه سانتیگراد قرار می گیرند. اگر واکنش مثبت باشد، تاخیر در همولیز در لوله آزمایش (مایع بی رنگ و رسوب گلبول قرمز)، در لوله کنترل، همولیز گلبول های قرمز مشاهده می شود.

ادبیات برای آماده شدن برای درس:

1. بوریسوف میکروبیولوژی، ویروس شناسی، ایمونولوژی. م.، 2002.

2. میکروبیولوژی پزشکی، ویروس شناسی و ایمونولوژی. اد. ... م.، 2004.

3. میکروبیولوژی پوزدیف. M.، GEOTAR-MEDIA، 2005.

11621 0

واکنش های سرولوژیکی مطابق با پدیده های همراه با تشکیل یک مجموعه آنتی ژن-آنتی بادی در طول تعامل اجزایی با خواص مختلف تعیین می شود. واکنش های آگلوتیناسیون، رسوب و لیز وجود دارد.

تست آگلوتیناسیون (RA)

واکنش آگلوتیناسیون (RA) مبتنی بر استفاده از یک آنتی ژن کورپوسکولار (تعلیق باکتری ها، گلبول های قرمز حساس، ذرات لاتکس و غیره) است که با آنتی بادی های خاص در تعامل است که در نتیجه آن کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی تشکیل شده رسوب می کند. این واکنش به طور گسترده در عمل آزمایشگاهی برای تشخیص سرولوژیک عفونت های باکتریایی و برای شناسایی میکروارگانیسم های جدا شده استفاده می شود.

RA برای تشخیص بسیاری از بیماری‌های عفونی استفاده می‌شود: بروسلوز (واکنش‌های رایت، هدلسون)، تولارمی، لپتوسپیروز (RAL - واکنش آگلوتیناسیون و لیز لپتوسپیرا)، لیستریوز، تیفوس (PAP - واکنش آگلوتیناسیون ریکتزیا)، شیگلوزیسینی‌وز، ، و سایر کاذب ها.

واکنش آگلوتیناسیون غیر مستقیم یا غیرفعال (RIGA یا RPGA).

برای مرحله‌بندی این واکنش، از گلبول‌های قرمز حیوانات (قوچ، میمون، خوکچه هندی، برخی از پرندگان) حساس به آنتی‌بادی یا آنتی‌ژن استفاده می‌شود که با انکوبه کردن سوسپانسیون گلبول‌های قرمز و محلول آنتی‌ژن یا سرم ایمنی حاصل می‌شود.

تشخیص به دست آمده بر اساس گلبول های قرمز حساس با آنتی ژن نامیده می شود تشخیص آنتی ژنی گلبول قرمز... آنها برای تعیین آنتی بادی ها در رقت های سریال سرم خون، به عنوان مثال، تشخیص شیگلوز گلبول های قرمز، سالمونلا اریتروسیتی O-diagnostics در نظر گرفته شده اند.

بر این اساس، تشخیص مبتنی بر گلبول های قرمز حساس به ایمونوگلوبولین های خاص نامیده می شود عتیقه(ایمونوگلوبولین) تشخیصیو آنها برای شناسایی آنتی ژن ها در مواد مختلف استفاده می کنند، به عنوان مثال، ایمونوگلوبولین گلبول قرمز دیفتری تشخیصی برای RIGA، که برای شناسایی اگزوتوکسین کورینه باکتریوم دیفتری در یک محیط غذایی مایع با کاشت مواد از بینی و اوروفارنکس در آن استفاده می شود.

واکنش هماگلوتیناسیون برای تشخیص هر دو عفونت باکتریایی (تب حصبه، تب پاراتیفوئید، اسهال خونی، بروسلوز، طاعون، وبا، و غیره) و ویروسی (آنفولانزا، عفونت های آدنوویروس، سرخک و غیره) استفاده می شود. RIGA از نظر حساسیت و ویژگی از RA پیشی می گیرد.

واکنش مهار هماگلوتیناسیون (RTGA)

واکنش مهار هماگلوتیناسیون (RTGA) برای تیتر کردن آنتی‌بادی‌های ضد ویروسی در سرم خون و همچنین برای تعیین نوع کشت‌های ویروسی جدا شده استفاده می‌شود. RTGA می تواند برای تشخیص آن ها استفاده شود عفونت های ویروسیکه عوامل ایجاد کننده آن خاصیت هماگلوتینه کنندگی دارند.

اصل روش این است که سرم حاوی آنتی بادی برای نوع خاصی از ویروس، فعالیت هماگلوتیناسیون آن را سرکوب می کند و گلبول های قرمز غیر آگلوتینه باقی می مانند.

واکنش مهار (تاخیر) هماگلوتیناسیون غیرفعال (RTPHA).

سه جزء در RTPHA وجود دارد: سرم ایمنی، آنتی ژن (مواد آزمایش) و گلبول های قرمز حساس.

اگر ماده آزمایش حاوی آنتی ژنی باشد که به طور خاص با آنتی بادی های سرم استاندارد ایمنی واکنش می دهد، آنها را متصل می کند و با افزودن بعدی گلبول های قرمز حساس شده با آنتی ژن همولوگ به سرم، هماگلوتیناسیون رخ نمی دهد.

RTPHA برای تشخیص آنتی ژن های میکروبی، برای تعیین کمی آنها و همچنین برای کنترل ویژگی RPHA استفاده می شود.

واکنش آگلوتیناسیون لاتکس (LAT)

ذرات لاتکس به عنوان حامل آنتی بادی ها (ایمونوگلوبولین ها) استفاده می شود. RLA یک روش اکسپرس برای تشخیص بیماری های عفونی با در نظر گرفتن زمان (حداکثر 10 دقیقه) و توانایی تشخیص آنتی ژن در حجم کمی از مواد آزمایشی است.

RLA برای نشان دادن آنتی ژن های استرپتوکوک پنومونیه، هموفیلوس آنفولانزا نوع b، نایسریا مننژیتیدیس در مایع مغزی نخاعی، برای شناسایی استرپتوکوک های گروه A در سواب گلو، برای تشخیص سالمونلوز، یرسینیوز و سایر بیماری ها استفاده می شود. حساسیت روش 1-10 نانوگرم در میلی لیتر یا 103-106 سلول باکتری در 1 میکرولیتر است.

واکنش انعقادی (RCoA)

واکنش انعقادی (RCoA) بر اساس توانایی پروتئین استافیلوکوک A برای اتصال ایمونوگلوبولین های خاص است. RCA - روشی برای تشخیص سریع - برای تشخیص آنتی ژن های پایدار در حرارت محلول در ترشحات انسانی و به عنوان بخشی از کمپلکس های ایمنی در گردش (CIC) استفاده می شود. تشخیص آنتی ژن های خاص در CEC مستلزم رسوب اولیه آنها از سرم خون است.

واکنش بارش

در واکنش رسوب (RP)، در نتیجه برهمکنش آنتی بادی ها با آنتی ژن های محلول بسیار پراکنده (پروتئین ها، پلی ساکاریدها)، مجتمع هایی با مشارکت مکمل تشکیل می شوند - رسوب می کنند. این یک تست حساس است که برای شناسایی و شناسایی طیف گسترده ای از آنتی ژن ها و آنتی بادی ها استفاده می شود. ساده ترین مثال از یک RP با کیفیت بالا، تشکیل یک نوار رسوب مات در یک لوله آزمایش در مرز لایه بندی آنتی ژن روی سرم ایمنی است - واکنش رسوب حلقه. انواع مختلف RP به طور گسترده در ژل های نیمه مایع آگار یا آگارز استفاده می شود (روش ایمونودیفیوژن مضاعف، روش ایمونودیفیوژن شعاعی، ایمونوالکتروفورز).

واکنش تثبیت کمپلمان (CBC)

واکنش تثبیت کمپلمان (CSC) بر اساس پدیده همولیز با مشارکت مکمل است. فقط قادر به تشخیص آنتی بادی های متصل به مکمل است.

RSK به طور گسترده ای برای تشخیص بسیاری از عفونت های باکتریایی و ویروسی، ریکتزیوز، کلامیدیا، مونونوکلئوز عفونی، عفونت های تک یاخته ای، کرمی استفاده می شود. CSC یک واکنش سرولوژیکی پیچیده است که در آن دو سیستم درگیر هستند: سیستم بررسی شده (سرم خون)، که توسط آنتی ژن-آنتی بادی و سیستم مکمل نشان داده می شود، و همولیتیک (گلبول های قرمز گوسفند + سرم همولیتیک). سرم همولیتیک یک سرم خون غیرفعال شده با گرم شدن خرگوش است که با گلبول های قرمز گوسفند واکسینه شده است. حاوی آنتی بادی علیه گلبول های قرمز گوسفند است.

اگر سرم آزمایش حاوی آنتی بادی های همولوگ با آنتی ژن باشد، نتیجه RSK مثبت - عدم وجود همولیز - مشاهده می شود. در این حالت کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی تشکیل شده به مکمل متصل می شود و در صورت عدم وجود مکمل آزاد، افزودن سیستم همولیتیک با همولیز همراه نیست. در غیاب آنتی بادی های مربوط به آنتی ژن در سرم، تشکیل کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی رخ نمی دهد، مکمل آزاد می ماند و سرم باعث همولیز گلبول های قرمز می شود، به عنوان مثال. وجود همولیز نتیجه منفی واکنش است.

یوشچوک N.D., Vengerov Yu.Ya.